氫飽和生理鹽水對重癥急性胰腺炎腎損傷的保護作用

石喬 廖康恕 趙凱亮 鄧文宏 楊波 左騰 陳辰 何小波 張家耀 王衛星

·論著·

氫飽和生理鹽水對重癥急性胰腺炎腎損傷的保護作用

石喬 廖康恕 趙凱亮 鄧文宏 楊波 左騰 陳辰 何小波 張家耀 王衛星

目的探討氫飽和生理鹽水對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腎損傷的保護作用及其機制。方法雄性Wistar大鼠54只，按數字表法隨機分為假手術組、ANP組和氫飽和生理鹽水處理(HRS)組，每組18只。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉方法制備ANP模型。HRS組在造模成功后5 min尾靜脈注射HRS6 ml/kg體重，并皮下滴注HRS20 ml/kg體重。假手術組大鼠開腹后僅翻動十二指腸和胰腺后關腹。假手術組和ANP組大鼠在術后5 min經尾靜脈注射生理鹽水(6 ml/kg體重)，并皮下滴注生理鹽水(20 ml/kg體重)。術后3、12、24 h分批處死大鼠，取血檢測血淀粉酶、肌酐、尿素氮含量。取新鮮腎組織制備勻漿，檢測其丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。取腎臟及胰腺組織行常規病理檢查，并在透射電鏡下觀察腎組織的超微結構。結果ANP組12 h時的血淀粉酶、肌酐、尿素氮水平，腎臟組織病理評分，MDA含量分別為(5396±500)U/L、(80.3±11.6)U/L、(14.1±2.1)U/L、(448.3±36.8)分、(7.03±0.85)nmol/mg，均較假手術組顯著升高(P值均<0.05)；SOD活性為(35.2±5.28)U/mg，較假手術組顯著降低(P<0.05)。HRS組的相應值分別為(5448±967)U/L、(41.9±8.6)U/L、(7.2±1.3)U/L、(315.2±39.6)分、(5.15±0.35)nmol/mg，較ANP組均顯著下降，但仍顯著高于假手術組(P值均<0.05)；SOD活性為(49.1±6.79)U/mg，較ANP組顯著升高，但仍顯著低于假手術組(P值均<0.05)。結論氫飽和生理鹽水對ANP大鼠的腎損傷具有一定程度的保護作用，其機制可能與抗氧化應激有關。

胰腺炎，急性壞死性； 腎功能衰竭； 氫飽和生理鹽水； 氧化應激

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一種常見的臨床急腹癥，病情兇險、進展迅速,常并發多器官功能障礙，病死率高達20%～40%[1]。急性腎衰竭(acute renal failure, ARF)是SAP的最常見嚴重并發癥之一，也是患者早期病死的重要原因。氫氣作為一種傳統的抗氧化劑，近年來證實可中和機體中氧自由基及減輕氧化應激，對多種疾病具有治療作用[2]。本研究旨在探討氫飽和生理鹽水(hydrogen-rich saline, HRS)對SAP腎損傷的保護作用及其機制，為臨床研究應用HRS治療SAP并發的腎損傷提供實驗依據和新思路。

材料與方法

一、實驗動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠54只，體重220～250 g，由湖北省疾病預防控制中心提供。采用隨機數字表法分為假手術組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組、氫飽和生理鹽水(HRS)組，每組18只。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)1 ml/kg體重的方法制備ANP模型。HRS組于造模后5 min經尾靜脈注射HRS(第二軍醫大學孫學軍教授惠贈)6 ml/kg體重，并皮下滴注HRS 20 ml/kg體重。假手術組大鼠開腹后僅翻動十二指腸和胰腺后關腹。ANP組和假手術組大鼠于術后5 min經尾靜脈注射生理鹽水6 ml/kg體重，并皮下滴注生理鹽水20 ml/kg體重。各組于術后3、12、24 h分別處死6只大鼠。心臟穿刺采血，離心分離血清，置-20℃保存備用。取胰頭和右腎(1/4極)組織用10%甲醛固定，取各組12 h點2只大鼠右腎(1/4極)組織用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，剩余腎組織置-80℃保存備用。

二、血淀粉酶、肌酐、尿素氮測定

采用全自動生化分析儀(日本奧林巴斯2700)測定血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平。

三、胰腺及腎臟組織病理學及超微結構檢查

取甲醛固定的胰腺及腎臟組織，常規石蠟包埋、切片、光鏡檢查，并根據Schimidt等[3]方法對胰腺水腫、出血壞死、胰腺腺泡破壞、炎癥及周圍炎性浸潤等進行病理評分，采用Paller等[4]的方法對腎小管損傷程度進行病理評分。隨機選擇10個高倍鏡視野，每個高倍鏡視野各隨機選擇10個腎小管進行評分。腎小管有明顯擴張、細胞扁平為1分；刷狀緣損傷或脫落為1分或2分；管型為2分；腎小管管腔內有脫落的、壞死的細胞，未成管型或細胞碎片為1分，取均值。

取戊二醛、鋨酸固定的腎臟組織，用EPON812包埋機(美國)包埋，LKB-V型超薄切片機(美國)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，H-300型透射電鏡(美國)觀察腎臟的超微結構。

四、腎組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量測定

取新鮮腎組織，加入生理鹽水，采用高速組織勻漿機(T10型，上海越磁電子科技有限公司)制備勻漿，以3000 r/min離心5 min，取上清組織勻漿液，采用MDA試劑盒及SOD試劑盒(均購自南京建成公司)分別檢測腎臟組織MDA、SOD含量。

五、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平變化

ANP組血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平均較同時間點假手術組顯著升高(t值分別為11.08、20.48、19.30,P值均<0.05)。HRS組12、24 h點大鼠的血清肌酐、尿素氮水平較同時間點ANP組顯著降低(t值分別為6.50、7.48、6.90、9.89,P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術組(t值分別為-2.87、-4.89、-6.07、-7.29,P值均<0.05)；血清淀粉酶活性與同時間點ANP組差異無統計學意義，但顯著高于假手術組(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺及腎臟組織病理學表現

假手術組胰腺組織未見異常；ANP組胰腺組織可見腺泡水腫、破裂，間質出血，有大量的炎性細胞浸潤，病理評分較假手術組顯著增加(P值均<0.05)；HRS組胰腺組織腺泡輕度水腫，間質內有少量出血及炎性細胞浸潤，病理評分較同時間點ANP組顯著降低(t值分別為5.79、7.42、6.49,P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術組(t值分別為-12.92、-9.27、-18.01，P值均<0.05，表1)。

假手術組腎臟組織均無異常改變；ANP組見部分腎小管明顯擴張，刷狀緣脫落、消失，管腔內可見脫落的上皮細胞及細胞碎片，腎小管上皮細胞腫脹，間質充血水腫，有少量中性粒細胞浸潤，并可見大量腎小管管型，病理評分較假手術組顯著增加(P值均<0.05)；HRS組腎小管上皮細胞腫脹、間質充血水腫等病理改變較ANP減輕，僅見少許腎小管管型(圖1)，病理評分較同時間點ANP組顯著降低(t值分別為7.13、6.03、8.70，P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術組(t值分別為-16.78、-15.87、-32.80，P值均<0.05，表1)。

圖1假手術組(a)、ANP組(b)、HRS組(c) 12 h點的腎臟組織病理改變(HE ×400)

三、腎臟超微結構的變化

假手術組腎臟組織的腎小管上皮細胞微絨毛排列整齊，胞核染色質分布均勻，無染色質核膜分離現象，線粒體大小基本一致，內質網排列整齊，無擴張；ANP組腎組織的腎小管上皮細胞微絨毛腫脹，排列混亂擁擠，細胞壞死、凋亡多見，部分腎小管上皮細胞胞核出現染色質核膜分離現象，核染色質濃縮、邊聚、呈環狀，有的核固縮、碎裂、呈不規則塊狀，細胞質高度腫脹，胞質內線粒體腫脹變形，嵴排列紊亂、斷裂，甚至呈空泡樣變；HRS組腎組織的腎小管上皮細胞微絨毛排列較整齊，細胞壞死、凋亡少見，胞質內線粒體僅輕度腫脹，無空泡樣改變，內質網輕度擴張，排列不整齊(圖2)。

圖2假手術組(a)、ANP組(b)、HRS組(c) 12 h點的腎臟組織超微結構改變(電鏡 ×6000, × 8000)

四、腎臟組織MDA含量和SOD活性的變化

ANP組大鼠腎組織MDA含量隨著時間延長逐漸升高，顯著高于同時間點假手術組(t值分別為-2.86、0.017、3.58,P值均<0.05)；HRS組大鼠腎組織中MDA含量較同時間點ANP組顯著降低(t值分別為3.64、5.00、5.32，P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術組(t值分別為-3.38、-12.67、-10.42,P值均<0.05，表1)。

ANP組大鼠腎組織SOD活性3 h時最高，12、24 h時降低，但均顯著低于假手術組(P值均<0.05)；HRS組大鼠腎組織SOD活性較同時間點ANP組顯著升高(t值分別為-2.36、-3.96、-2.45，P值均<0.05)，但仍顯著低于假手術組(t值分別為2.76、5.59、5.70，P值均<0.05，表1)。

討 論

氫氣是一種分子量很小的還原劑，能自由通過生物膜結構進入細胞及細胞器中，但以往大部分學者認為其屬于生理性惰性氣體，不參與機體生物化學反應。2007年Ohsawa等[5]首次提出氫氣可選擇性地中和羥自由基和亞硝酸陰離子，且不干擾其他自由基在細胞信號傳遞間的正常氧化還原反應。由于機體缺乏清除氧自由基(ROS)特異性酶，氧化應激反應時機體產生大量的ROS不能被清除，對組織器官造成損害，因此，氫氣被認為是一種理想的抗氧化劑。之后，有學者在缺血再灌注、膿毒血癥、創傷性胰腺炎及精氨酸誘導的胰腺炎等模型中證實了氫氣及氫飽和生理鹽水具有抗氧化作用[6-9]，但尚未見其對SAP胰外臟器損傷保護的報道。

表1 3組大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN水平及胰腺、腎臟組織病理評分的變化

注：與假手術組同時間點比較，aP<0.05；與ANP組同時間點比較,bP<0.05

急性腎損傷是SAP常見的并發癥，其機制主要與大量活化的胰酶釋放入血引起的腎小管壞死，炎癥遞質及氧化應激損傷有關[10-11]。此外，SAP時出現的低血容量休克導致腎組織缺血、缺氧以及血供恢復時缺血-再灌注所產生的大量ROS也是腎損傷的重要原因[12]。MDA是氧自由基攻擊生物膜引發脂質過氧化反應的終產物，其含量的高低反映脂質過氧化反應的程度[13]，也間接提示組織細胞膜破壞的嚴重程度。SOD是一種內源性非特異性抗氧化酶，其通過自身的抗氧化作用而減輕ROS對組織器官的損傷[14]，因此，SOD活力的高低也反映了氧化應激反應的程度。

本研究結果顯示，與ANP組比較，HRS組大鼠血清肌酐、尿素氮水平顯著下降，腎臟組織病理損傷及超微結構損傷減輕，病理評分顯著降低，腎組織勻漿的MDA含量顯著下降，SOD活性顯著升高，說明氫飽和生理鹽水對SAP時的腎損傷具有一定程度的保護作用，其機制與抗氧化應激有關。

本研究中的HRS組大鼠血肌酐、尿素氮在12 h最低，24 h又輕度升高，其可能原因是氫飽和生理鹽水中的有效成分氫氣在早期中和了大量的ROS，減少了ROS誘導的炎性通路的激活，抑制了炎癥級聯反應，其在12 h腎損傷得到最大程度的改善，24 h又輕度升高，可能是藥物的代謝殆盡，隨著胰腺炎的進展，進一步出現了腎功能的損害，導致肌酐、尿素氮升高，腎臟病理評分有所升高。

(致謝：感謝第二軍醫大學孫學軍教授為本課題組惠贈氫氣飽和生理鹽水以及對該研究的大力支持。)

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ProtectiveeffectofhydrogenrichsalineonrenalinjuryofsevereacutepancreatitisSHI

Qiao,LIAOKang-shu,ZHAOKai-liang,DENGWen-hong,YANGBo,ZUOTeng,CHENChen,HEXiao-bo,ZHANGJia-yao,WANGWei-xing.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

WANGWei-xing,Email:sate.llite@163.corn

ObjectiveTo investigate the protective effect of hydrogen-rich saline on renal injury of rats with acute necrotizing pancreatitis and its mechanism.MethodsFifty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups: sham operation group (SO group), acute necrotizing pancreatitis group (ANP group) and hydrogen-rich saline treatment group (HRS group), with 18 rats in each group. Acute necrotizing pancreatitis model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Hydrogen-rich saline was injected through the tail vein (6 ml/kg) and subcutaneously (20 ml/kg) at 5 minutes after the operation in HRS group. The rats of SO group underwent laparotomy with gentle pancreas, duodenum manipulation only. The rats of SO group and ANP group were administered with intravenous (6 ml/kg) and subcutaneous (20 ml/kg) injection with saline. Rats in each group were sacrificed at 3, 12 and 24 h after the operation. The levels of serum amylase, creatinine, urea nitrogen were determined.Fresh renal tissue was prepared and renal malondialdehyde (MDA), renal superoxide dismutase (SOD) activity were measured. Pathological changes of renal and pancreas tissues were examined and pathological scores were recorded. Ultrastructural changes of renal tissues were observed under a transmission electron microscope.ResultsThe levels of serum amylase, creatinine, urea nitrogen, renal histopathological scores, MDA were (5396±500)U/L, (80.3±11.6)U/L, (14.1±2.1)U/L, (448.3±36.8), (7.03±0.85)nmol/mg, which were significantly higher than those in SO group (P<0.05), but the renal SOD activity was (35.2±5.28)U/mg, which were significantly lower than that in SO group (P<0.05). The corresponding values in HRS group were (5448±967)U/L, (41.9±8.6)U/L, (7.2±1.3)U/L, (315.2±39.6), (5.15±0.35) nmol/mg, which were significantly lower than those in ANP group, but were significantly higher than those in SO group (P<0.05). The renal SOD activity was (49.1±6.79)U/mg, which were significantly higher than that in ANP group, but was significantly lower than that in SO group (P<0.05).ConclusionsHydrogen-rich saline has a protective effect on renal injury of ANP, and its mechanism may be related to anti-oxidative stress.

Pancreatitis, acute necrotizing; Kidney failure; Hydrogen-rich saline; Oxidative stress

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.008

國家自然科學基金(81070368)；中央高校基本科研業務費專項資金資助(2012302020202)

430060 武漢，武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科(石喬、趙凱亮、鄧文宏、楊波、左騰、陳辰、何小波、王衛星)；武漢大學恩施臨床學院 湖北省恩施州中心醫院肝膽外科(廖康恕、張家耀)

王衛星，Email: sate.llite@163.com

2012-12-11)

(本文編輯：屠振興)