連接黏附分子C單抗對小鼠急性壞死性胰腺炎肝損傷的保護作用

胡端敏 楊勇 唐文

連接黏附分子C單抗對小鼠急性壞死性胰腺炎肝損傷的保護作用

胡端敏 楊勇 唐文

重癥急性胰腺炎(SAP)往往伴有多器官的功能損傷，其中肝臟的損傷十分多見，且肝功能損害程度對預測SAP預后尤為重要。SAP導致的炎癥細胞過度激活和在肝臟組織的浸潤是肝功能損傷的重要機制[1]，其中細胞黏附分子粘附于炎癥細胞的過程,對白細胞過度激活以及SAP時臟器損傷的發生、發展有重要意義。連接黏附分子C(junctional adhesion molecule-C, JAM-C)是近年新發現的在血管內皮細胞上分布的細胞黏附分子，它介導中性粒細胞向炎癥部位和組織損傷處浸潤和聚集[2]。本研究組前期的研究發現，JAM-C在急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)小鼠全身主要器官的表達明顯增高[3]。本研究應用抗JAM-C單抗干預ANP小鼠，觀察抑制了JAM-C介導的粘附作用對ANP小鼠肝損傷的影響。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：清潔級昆明小鼠18只，雌雄不分，體質量(20±2)g，購自蘇州大學動物實驗中心。按完全隨機法將小鼠分為對照組、ANP組、JAM-C單抗處理組(抗體組)，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg體質量，美國Sigma公司)6次，間隔1 h的方法制備ANP模型，末次注射后立即腹腔注射內毒素10 mg/kg體質量?？贵w組以同樣方法制備ANP模型，同時在首次注射雨蛙素30 min后腹腔內注射羊抗小鼠JAM-C單抗0.3 ml(300 μg，美國R&D公司)，末次雨蛙素注射后腹腔內注射內毒素10 mg/kg體質量。

2．血清酶學和TNF-α濃度測定：在末次注射后3 h，心臟穿刺收集血液，應用OLYMPUS全自動生化儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和淀粉酶活性，采用ELISA法測定血清TNF-α水平，ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，操作步驟均嚴格按照說明書。

3．胰腺、肝臟組織病理檢查：取血后用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹取胰腺及肝臟組織，置10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。按Schmidt等[4]和Mota等[5]的標準分別對胰腺和肝臟組織行病理學評分。

二、結果

1．胰腺病理變化及評分：對照組胰腺組織正常(圖1)。ANP組胰腺高度水腫，腺泡呈孤島狀，廣泛腺細胞壞死，細胞結構模糊不清，胞質內空泡形成，局部有融合性壞死灶，壞死區有大量中性粒細胞和單核細胞浸潤(圖1)，胰周脂肪壞死，有大量炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，間質內動脈痙攣，靜脈明顯擴張淤血，炎癥細胞附邊，局部血管壁出血、壞死。抗體組胰腺間質充血水腫，有中性粒細胞和單核細胞浸潤，少量局灶性腺泡壞死，血管病變不明顯，無出血(圖1)。對照組、ANP組、抗體組胰腺病理評分分別為0、(9.3±1.3)、(6.2±1.1)分，抗體組評分較ANP組顯著降低(P<0.05)。

2．肝臟病理變化及評分：對照組肝臟組織結構未見明顯異常(圖1)。ANP組肝臟充血，肝小葉內肝索結構紊亂，肝細胞廣泛空泡樣變性，肝血竇內充滿紅細胞，門管區炎癥細胞浸潤(圖1)?？贵w組肝細胞腫脹明顯，散在空泡樣變性，少量炎細胞浸潤(圖1)。對照組、ANP組、抗體組肝臟組織病理評分分別為0、(7.8±1.6)、(5.2±1.1)分，抗體組評分較ANP組顯著降低(P<0.05)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)、抗體組(c)胰腺(左)和肝臟(右)的病理變化(HE ×100)

3．血清ALT、AST、淀粉酶、TNF-α水平的變化：對照組、ANP組、抗體組的ALT分別為(40±5)、(121±26)、(85±16)U/L；AST分別為(118±18)、(386±42)、(258±36)U/L；淀粉酶分別為(1876±245)、(17985±1064)、(13870±988)U/L；TNF-α分別為(58±13)、(628±48)、(320±23)ng/L。ANP組各指標均顯著高于對照組，抗體組各指標均較ANP組顯著降低，但仍顯著高于對照組(P值均<0.05)。

討論JAM-C是免疫球蛋白超家族成員之一，它主要分布在白細胞、血小板、各種上皮及血管內皮細胞上。在腹膜炎[6]、肺炎[7]、皮膚炎癥[8]、關節炎[9]等動物模型的研究中發現JAM-C增加了中性粒細胞在炎癥部位和組織損傷處的浸潤和聚集。

Rau等[10]使用細胞間黏附分子-1(ICAM-1)單抗預處理ANP大鼠，結果有效地減少了ANP大鼠胰腺內的白細胞浸潤，明顯降低了胰腺炎癥的病理評分，抑制了胰腺的早期壞死和后期的細胞凋亡。Hartwig等[11]報道，阻斷黏附分子L選擇素的表達能明顯降低白細胞滲出和肺損害。這些研究的重點主要是針對介導白細胞趨邊、滾動和初步粘附的分子。JAM-C主要分布在血管內皮細胞間的緊密連接上，它的配體主要是分布在各種白細胞上的整和素Mac-1(αLβ2、CD11b/CD18)。正是由于這種細胞膜分布上的特異性，JAM-C在白細胞激活向炎癥區域募集的過程中主要作用于白細胞的跨壁穿越過程。Chavakis等[12]使用JAM-C的可溶形式(sJAM-C)結合中性粒細胞上的整和素Mac-1后，發現血管炎癥明顯減輕，且白細胞滲出也明顯減少。Scheiermann等[13]報道，拮抗JAM-C能使缺血再灌注損傷小鼠的中性粒細胞血管外滲明顯減少。Vonlaufen等[14]發現高表達JAM-C的轉基因小鼠制備ANP模型后胰腺和肺組織炎癥損傷明顯重于正常小鼠制備的ANP模型。本研究結果顯示，JAM-C單抗處理后的ANP小鼠胰腺和肝臟組織的病理損傷明顯減輕，血清ALT、AST、淀粉酶水平顯著下降，同時血TNF-α水平亦顯著下降。因TNF-α是ANP合并全身炎癥反應綜合征的主要炎癥因子，與急性胰腺炎的臨床預后密切相關[15]，故用抗體中和JAM-C后不僅能減輕ANP小鼠胰腺和肝臟組織的炎癥損傷，還可能有效緩解全身炎癥反應。因此，阻斷參與ANP后期細胞事件的黏附分子JAM-C可能成為治療ANP肝損傷的有效治療方法。

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2013-05-15)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.017

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唐文，Email: sztangwen@163.com