吡格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的作用

徐萍 婁曉麗 陳誠

·論著·

吡格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的作用

徐萍 婁曉麗 陳誠

目的探討吡格列酮在重癥急性胰腺炎發病機制中與凋亡激活的關系。方法將80只SD大鼠按隨機表法分為急性壞死性胰腺炎組(ANP組)、假手術組、二甲基亞砜溶劑對照組(DMSO組)、吡格列酮干預組(吡格列酮組)，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體質量的方法制作ANP模型，吡格列酮組在造模前30 min腹腔注射吡格列酮40 mg/kg體質量。術后1、3、6、12 h分批處死大鼠，收集胰腺組織。采用常規HE染色進行胰腺組織病理評分，采用TUNEL染色方法檢測大鼠胰腺細胞凋亡，免疫組化法和蛋白質印跡法檢測胰腺組織PPARγ的表達變化，同時檢測胰腺組織caspase 3的表達變化。結果吡格列酮干預后大鼠胰腺組織病理損傷較ANP組大鼠有所減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。吡格列酮組胰腺組織PPARγ表達水平為2.69±0.46，顯著高于ANP組的0.75±0.05，差異有統計學意義(P<0.05)。吡格列酮3 h組大鼠胰腺細胞凋亡指數為8.35±0.95，顯著高于同時點ANP組的4.37±1.22；caspase 3的活性為9.24±1.78，顯著高于ANP組的5.04±0.86，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。結論吡格列酮干預后大鼠胰腺炎癥減輕，PPARγ和caspase 3表達升高，胰腺細胞凋亡率升高。

胰腺炎，急性壞死性； 噻唑烷二酮類； 吡格列酮； PPARγ； 細胞凋亡

對于重癥急性胰腺炎(SAP)的發病特點，多數學者認為炎癥反應與胰腺細胞的凋亡有著密切聯系[1]。吡格列酮屬噻唑烷二酮(TZDs)類化合物，為高選擇性過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisone proliferators activated receptors,PPARγ)激動劑，具有明顯的抗炎和雙向調節細胞凋亡的效應[2-3]。細胞凋亡與急性胰腺炎(AP)病程及預后密切相關，其可能發揮的有利作用為治療SAP提供了新思路[4]。本研究應用吡格列酮干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，探討吡格列酮與胰腺細胞凋亡激活的關系。

材料和方法

一、動物模型建立及分組

80只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級，鼠齡2～2.5個月，體質量160～200 g，由上海交通大學附屬第一人民醫院動物實驗中心提供。按隨機表法分為ANP組、假手術組、二甲基亞砜(DMSO)組和吡格列酮組，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體質量的方法制作ANP模型。假手術組只翻動胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關腹。吡格列酮組在制模前30 min腹腔注射DMSO溶解的吡格列酮40 mg/kg體質量。DMSO組在制模前腹腔注射等容積DMSO。術后1、3、6、12 h分批處死大鼠，取胰頭部組織，部分用10%中性緩沖甲醛固定，部分液氮保存。

二、指標檢測

1．胰腺組織病理檢查：固定的胰頭部組織常規石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察胰腺組織病理改變，每片隨機選取8～10個高倍視野，采用Schimidt等[5]標準從水腫、炎癥細胞浸潤、出血、壞死程度4個方面進行評分， 4個評分相加為總評分。

2．胰腺組織PPARγ蛋白表達檢測： 取6 h組的胰腺石蠟包埋組織，切片，采用免疫組化方法檢測PPARγ蛋白表達，計數10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞的百分率。另取凍存的胰腺組織100 μg，提取總蛋白，采用蛋白質印跡法檢測PPARγ蛋白表達，以β-actin為內參，以PPARγ條帶與β-actin條帶灰度比值作為蛋白表達量。實驗重復3次，取均值。

3．胰腺組織細胞凋亡檢測：取胰腺石蠟包埋組織，切片，采用TUNEL法檢測細胞凋亡。TUNEL原位檢測試劑盒購自上海碩盟有限公司，按說明書操作。取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算細胞的凋亡指數。

4．胰腺組織caspase 3活性的檢測：取凍存的胰腺組織，提取總蛋白，采用分光光度法檢測caspase 3活性，嚴格按試劑盒(上海碩盟有限公司)說明書操作。實驗重復3次，取均值。

三、統計學處理

結 果

一、各組胰腺組織病理學改變

假手術組大鼠胰腺組織結構清晰，大部分腺泡小葉完整，偶見炎性細胞浸潤，未見間質充血、出血和腺泡細胞壞死；ANP組大鼠胰腺組織可見腺泡細胞變性、壞死，小葉結構明顯破壞，小葉間質水腫，片狀出血，炎性細胞浸潤；吡格列酮組大鼠胰腺組織未見腺泡細胞壞死，小葉結構存在，部分間質水腫，少量炎性細胞浸潤，偶見點狀出血(圖1)。ANP組的胰腺病理評分較假手術組及DMSO組顯著增加，吡格列酮組的胰腺病理評分較ANP組顯著降低，但仍顯著高于假手術組和DMSO組(P值均<0.05，表1)。

二、各組胰腺組織PPARγ蛋白表達

PPARγ主要定位于胰腺腺泡細胞的胞核，出現棕色顆粒為陽性表達(圖1)。假手術組、ANP組、吡格列酮組大鼠胰腺組織PPARγ表達量分別為30.19±3.01、13.28±1.53、44.06±7.55；蛋白質印跡法檢測的上述各組PPARγ的表達量分別為1.34±0.09、0.75±0.05、2.69±0.46(圖2)。ANP組大鼠術后胰腺PPARγ表達水平與假手術組比較差異無統計學意義，但吡格列酮組大鼠胰腺PPARγ表達水平顯著高于ANP組大鼠(F=10.442，P=0.004)。

圖1假手術組(上)、ANP組(中)、吡格列酮組(下)大鼠術后6 h時胰腺組織的病理改變(左，HE ×400)及PPARγ的表達(右，免疫組化 ×400)

表1 各組大鼠胰腺組織的病理評分

注：與假手術組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

三、各組大鼠胰腺腺泡細胞的凋亡及caspase 3的活性

ANP組大鼠胰腺腺泡細胞的凋亡及caspase 3活性均較假手術組顯著增加，吡格列酮組胰腺的細胞凋亡及caspase 3活性又均較ANP組顯著增加(P值均<0.05，圖3，表2、3)。

圖2假手術組(1)、ANP組(2)、吡格列酮組(3)大鼠術后6 h時胰腺PPARγ的表達(蛋白質印跡法)

圖3假手術組(a)、ANP組(b)、吡格列酮組(c)大鼠術后6 h時胰腺腺泡細胞的凋亡(TUNEL法 ×400)

表2 各組大鼠胰腺腺泡細胞的凋亡指數

表3 各組大鼠胰腺組織caspase3的活性變化

討 論

SAP發病早期，胰腺組織常出現明顯的出血壞死及炎癥細胞浸潤[4]。周杰等[5]研究發現，重癥胰腺炎細胞主要以壞死為主，慢性胰腺炎則以凋亡的形式清除細胞。Wang等[6]研究提示，胰腺腺泡細胞的不同死亡方式在胰腺疾病的發生、發展中起著重要作用，誘導胰腺細胞凋亡可減輕胰腺炎癥反應。

吡格列酮是PPARγ激動劑，可雙向調節細胞凋亡，同時能夠減輕炎癥反應[7-10]。本研究組前期研究發現，吡格列酮干預ANP大鼠時，其通過活化caspase 3，抑制NF-κB p65表達，阻遏肺組織中性粒細胞浸潤等抗炎機制從而抑制實質細胞的過度凋亡[11]。Masamune等[12]利用人胰腺腺泡細胞AR42J建立了AP細胞模型，發現吡格列酮能促進胰腺細胞的凋亡從而減輕炎癥。本研究結果顯示，吡格列酮干預后，大鼠胰腺組織病理評分明顯下降，PPARγ表達升高，胰腺組織的凋亡明顯升高，說明吡格列酮通過促進細胞凋亡，減輕胰腺組織的炎癥，從而減輕胰腺組織的病理損傷。與上述研究結果一致。

邵宏偉等[13]研究發現，在急性單純水腫性胰腺炎時極少有腺泡細胞凋亡，AP的嚴重程度與腺泡細胞的凋亡率在程度較輕的急性出血壞死性胰腺炎時呈正相關，而在程度較重的急性出血壞死性胰腺炎時則呈負相關。本結果顯示，吡格列酮能夠促進ANP大鼠胰腺細胞的凋亡，同時激活PPARγ和caspase 3，減輕胰腺的炎癥反應，對ANP具有一定的保護作用。

[1] Xu P, Xu K, Wang J, et al. Pioglitazone: A Promising Therapeutic Tool in Sodium Taurocholate-Induced Severe Acute Pancreatitis. Dig Dis Sci, 2011, 56:1082-1089.

[2] Zhang HF, Wang L, Yuan HJ, et al. PPAR-γ agonist pioglitazone prevents apoptosis of endothelial progenitor cells from rat bone marrow. Cell Biol Int, 2013, 37:430-435.

[3] Mieczkowska A, Baslé MF, Chappard D, et al.Thiazolidinediones induce osteocyte apoptosis by a G protein-coupled receptor 40-dependent mechanism. J Biol Chem, 2012, 287:23517-23526.

[4] Novovic S, Andersen AM, Ersboll AK，et al. Proinflammatory cytokines in alcohol or gallstone induced acute pancreatitis. A prospective study. JOP，2009，10:256-262．

[5] 周杰，楊燕，周五一，等. 細胞凋亡及相關基因在胰腺疾病中的作用. 中國普通外科雜志, 2004,13: 465-467.

[6] Wang J, Chen G, Gong H, et al. Amelioration of Experimental Acute Pancreatitis with Dachengqi Decoction via Regulation of Necrosis-Apoptosis Switch in the Pancreatic Acinar Cell. PLoS One, 2012, 7:e40160.

[7] Xu P, Zhou XJ, Chen LQ, et al. Pioglitazone attenuates the severity of sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2007, 13:1983-1988.

[8] Ogawa Y, Yoneda M, Tomeno W, et al. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Exacerbates Concanavalin A-Induced Liver Injury via Suppressing the Translocation of NF-kappaB into the Nucleus. PPAR Res, 2012:940384.

[9] Schmidt MV, Paulus P, Kuhn AM, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma-induced T cell apoptosis reduces survival during polymicrobial sepsis. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184:64-74.

[10] Li S, Zhou Q, He H, et al. Peroxisome Proliferator-activated Receptor γ Agonists Induce Cell Cycle Arrest through Transcriptional Regulation of Krüppel-like Factor 4(KLF4). J Biol Chem, 2013,288:4076-4084.

[11] 謝俊峰，徐萍，謝勇，等.匹格列酮對重癥急性胰腺炎肺組織中核因子-κB及Caspase3表達的影響.中華消化雜志，2011,31: 704-705.

[12] Masamune A, Satoh K, Sakai Y, et al. Ligands of Peroxisome Proliferator-activated Recepto-γ Induce Apoptosis in AR42J Cells. Pancreas, 2002,24:130-138.

[13] 邵宏偉，齊清會. 急性胰腺炎與胰腺腺泡細胞凋亡的關系. 中華普通外科雜志,2003 ,18: 23-24.

Effectofpioglitazoneonpancreaticapoptosisinratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUPing,LOUXiao-li,CHENCheng.

DepartmentofGastroenterology,SongjiangBranch,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai201600,China

Correspondenceauthor:XUPing,Email:sjzxxp@yeah.net

ObjectiveTo investigate the effect of pioglitazone on the activation of pancreatic apoptosis in the pathogenesis of rats with acute necrotizing pancreatitis.MethodsEighty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups, including acute necrotizing pancreatitis (ANP), sham operation (SO), solvent control (Solvent), pioglitazone intervention (pioglitazone)group, with 20 rats in each group. ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (1ml/kg body weight) into the biliary-pancreatic duct. The rats in pioglitazone group were injected pioglitazone (40 mg/kg body weight) into the ANP abdominalcavity 30 min before mldel induction. The rats were sacrificed at 1 h, 3 h, 6 h, and 12 h after ANP model induction. The pancreatic tissues were harvested. Routine HE staining was used to evaluate pancreatic pathological damage. The apoptosis was determined by TUNEL method. The expression of PPARγ was determined by using immunohistochemistry and Western-blot methods. The activity of caspase3 in pancreatic tissues was detected by using spectrophotometry.ResultsThe pancreatic pathological damage was attenuated in rats in pioglitazone group compared with that in rats of ANP group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The PPARγ expression of pioglitazone group was 1.34±0.09, which was significantly higher than that in ANP group (0.75±0.05), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The apoptotic index in pioglitazone group at 3 h was 8.35±0.95, which was significantly higher than that in ANP group at 3 h (4.37±1.22); the caspase3 activity was 9.24±1.78, which was significantly higher than that in ANP group (5.04±0.86), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPioglitazone intervention attenuates pancreatic inflammation, increases PPARγ expression and caspase3 activity and induces apoptosis in pancreas of rats with acute necrotizing pancreatitis.

Pancreatitis, acute necrotizing; Thiazolidinediones; Pioglitazone; PPAR gamma; Apoptosis

2013-06-12)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.010

2010年上海市自然科學基金(10ZR1427900)；上海市松江區領先合作項目(2011LX01)

201600 上海，上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院 松江區中心醫院消化內科(徐萍、陳誠)，中心實驗室(婁曉麗)

徐萍， Email: sjzxxp@yeah.net