HPLC法測定維A酸的平衡溶解度及表觀油水分配系數

蔡文娟 王伯濤 王濟奎

1.南京工業大學理學院，江蘇南京 211816；2.南京工業大學藥學院，江蘇南京 211816

維A酸又稱維甲酸、視黃酸[1-2]，是維生素A的活性代謝中間產物[3]。維A酸為多烯酸結構的化合物，在光的影響下，易發生異構化反應，迅速轉化為異維A酸[4-5]。維A酸可影響骨的生長和上皮代謝，能促進上皮細胞增殖分化和角質溶解[6]，亦起到抑制腫瘤、治療痤瘡和銀屑病等作用[7-8]，目前已應用于臨床，但關于維A酸的溶解度及油水分配系數的研究，國內外均鮮有報道。本文建立HPLC法，模擬人體皮膚環境，在32℃下，pH為5.8時測定了平衡溶解度及油水分配系數，為維A酸劑型的研究提供參考。

1 儀器與試劑

LC-10ATvp島津高效液相色譜儀；HW-2000色譜數據處理系統；BT 125D電子分析天平；SK2510HP超聲波清洗器；THZ-22臺式恒溫振蕩器。

維A酸原料藥（東北制藥集團股份有限公司，批號：0311 203001）；維A酸對照品（美國SIGMA公司，批號：J1F266）。

甲醇為色譜純；冰醋酸、正辛醇為分析純；水為去離子水。

2 方法及結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取維A酸對照品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取維A酸供試品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸供試品儲備液。精密吸取供試品儲備液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性試驗

2.2.1 流動相的選擇 《英國藥典》“維A酸”流動相條件為：甲醇-水-冰醋酸（770∶225∶5）；《美國藥典》“維 A 酸”流動相條件為：異辛烷-異丙醇-冰醋酸（99.65∶0.25∶0.1）；《中國藥典》2010年版“維A酸”流動相條件為：甲醇-2%冰醋酸溶液（81∶19）。 綜合 3 種條件，以《中國藥典》2010 年版“維 A酸”流動相為起始條件，進行試驗，并在此基礎上優化。結果見表1。

2.2.2 色譜條件的確定 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）為流動相，檢測波長為 355 nm；流速為 1.0 mL/min，柱溫為 40℃，進樣量為 20 μL。

在此色譜條件下，取適當濃度的維A酸對照品及供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，理論塔板數按維A酸峰計不低于9 000，維A酸保留時間為13.4 min，拖尾因子為1.01，其雜質對主峰測定無干擾。結果見圖1。

表1 流動相的選擇

2.3 線性關系考察

稱取維A酸對照品20 mg，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液 1、2、3、4、5 mL 置于 100 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積（A）對濃度（C）作線性回歸，考察線性關系，并求得標準曲線方程。標準曲線方程Y=91 399X+18 088，r=0.999 8（n=5）。 結果表明，在 4.04～20.20 μg/mL的濃度范圍內，峰面積與濃度的線性關系良好。

2.4 精密度試驗

按“2.1.2”項下配制6份濃度為10 μg/mL的維A酸供試品溶液，平行進樣6次，計算6份溶液的RSD值。結果表明，6份樣品的RSD值為0.64%，說明本方法精密度好。

2.5 準確度試驗

按“2.1.2”項下配制低、中、高3個濃度的維A酸供試品，溶液濃度分別為 8、10、12 μg/mL。精密吸取供試品溶液，及“2.1.1”項下的對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以外標法計算供試品溶液中維A酸含量，并計算回收率。高、中、低3種濃度的準確度均好。結果見表2。

表2 回收率測定結果

2.6 溶液穩定性考察

按“2.1”項下配制濃度為20 μg/mL的維A酸溶液及對照品溶液。分別于0、12、24 h時測定其含量，結果見表3。結果表明維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中24 h內穩定性良好。

表3 維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中的穩定性

2.7 平衡溶解度的測定

2.7.1 水中的溶解度 稱取維A酸20 mg，置具塞三角瓶中，加水500 mL，于恒溫振蕩器32℃下振搖24 h，靜置12 h，分取上清液200 mL于分液漏斗中，加入1 mL二氯甲烷萃取，重復萃取兩次。下層液置于2 mL容量瓶中。精密吸取供試品和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。由外標法計算維A酸在水中的溶解度。經計算得維A酸在水中的溶解度小于0.1 mg/mL。

《中國藥典》2010年版二部“維A酸”正文中對其溶解度的描述為：“在水中幾乎不溶”，“幾乎不溶”系指溶質1 g（mL）在溶劑10 000 mL中不能完全溶解，本試驗所測結果與其描述一致。

2.7.2 正辛醇中的溶解度 稱取維A酸50 mg置棕色量瓶中，加正辛醇10 mL溶解，32℃振搖24 h，靜置觀察，若維A酸完全溶解，則繼續加維A酸，每次50 mg，32℃振搖24 h至溶液達到飽和，恒溫靜置12 h，精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻。經外標法計算得維A酸在正辛醇中的溶解度為6.25 mg/mL。

2.8 表觀油水分配系數的測定

人體皮膚pH值為4.5～6.5，平均5.75，體表溫度32℃，為模擬人體環境，故選擇pH 5.8的磷酸鹽緩沖體系，并在32℃下進行試驗。

2.8.1 水相的配制 按 《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩⅤD配制磷酸鹽緩沖液（pH=5.8）100 mL。油相為正辛醇溶液。

2.8.2水飽和正辛醇溶液及正辛醇飽和水溶液的制備 分別量取60 mL油相和水相溶液置于分液漏斗中，32℃下振搖12 h，靜置過夜。上層為磷酸鹽飽和的正辛醇，下層為正辛醇飽和的磷酸鹽緩沖液。

取維A酸12.5 mg，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加磷酸鹽飽和的正辛醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液15 mL，精密吸取正辛醇飽和的磷酸鹽溶液15 mL，置分液漏斗中，充分振搖，于32℃恒溫靜置至水相澄清。精密吸取上層油相2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，作為油相供試品溶液。同時，精密吸取下層正辛醇飽和的水溶液20 μL作為水相供試品溶液。

精密稱取維A酸對照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。繼續精密吸取2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

分別精密量取供試品溶液和對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由外標法計算油相及水相中維A酸的濃度，分別記作C1，C2，按公式計算表觀油水分配系數：Papp=C1/C2，lgP=lgC1/C2。其中，C1為藥物分配平衡時，維 A酸在正辛醇中的濃度，C2為維A酸在水中的濃度。經過外標法計算得，表觀油水分配系數為36 079.8，lgP值為4.55。

3 討論

3.1 流動相的選擇

先通過調整甲醇和水的比例來選擇最佳保留時間。當甲醇比例在81%～90%時，提高甲醇比例能大幅縮短主峰的保留時間，但當甲醇比例大于90%時，主峰保留時間略有縮短，分離度降低，但過小的保留時間不利于主峰前雜質完全分離。若保留時間過長，則造成分析效率降低、檢測成本增加。綜合考慮，選擇甲醇-水的比例為90∶10。

再通過改變流動相中冰醋酸比例來調整峰型。將表1編號 2、3、9，5、6，7、8 號列為三組，比較同組的試驗結果，可以看出，當冰醋酸比例變大時，可以縮短保留時間，主峰拖尾因子略微升高，但分離度降低，綜合考慮冰醋酸比例還是0.4最佳。

因此，選擇最佳流動相比例為：甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）。

3.2 油水分配系數的意義

藥物在體內的溶解、吸收、分布、轉運與藥物的水溶性、脂溶性有關，即和油水分配系數有關。藥物要有適當的脂溶性，才能透過生物膜[9]，而水溶性有利于藥物在體液內轉運，達到作用部位與受體結合，從而產生藥效，所以藥物需要有適當的油水分配系數。

一般認為油水分配系數對數的最佳值，lgP在-1～2[10]。在此范圍內，藥物最易透皮。測量出的lgP大于2，表明本品屬于強脂溶性藥物（lgP＞4），不宜作透皮用，同時，鑒于維A酸的毒副作用，筆者不建議本藥品透皮。因此，油水分配系數的測定對劑型的預測有一定的指導意義。

[1]張強，鄭繼海.實用臨床藥物手冊[M].鄭州：鄭州大學出版社，2009:213-213.

[2]王春艷，劉文君.急性白血病對維A酸耐藥及其逆轉研究進展[J].實用兒科臨床雜志，2011，26（3）：216-219.

[3]汪濤，鄧樹海.HPLC法測定維A酸在小鼠骨髓中的含量[J].中國新藥雜志，2010，19（16）：1474-1472.

[4]邵鳳.維A酸軟膏中抗氧劑的初步篩選[J].中國藥房，2001，12（12）：714-715.

[5]魏立明，宋霞，宋三孔，等.HPLC雙波長法同時測定復方維A酸軟膏中 2 主藥的含量[J].中國藥房，2012，23（8）：737-739.

[6]袁華，封宇飛.48例維A酸不良反應文獻分析[J].藥物流行病學雜志，2011，20（7）：368-370.

[7]唐露笑，陳宏輝.維甲酸類藥物在肝癌治療中的應用[J].現代醫藥衛生，2012，28（3）：416-418.

[8]詹凌，陳德宇，李紅林.維甲酸類藥物治療痤瘡和銀屑病臨床療效觀察[J].社區醫學雜志，2011，9（22）：5-6.

[9]張銳，施旻，劉建群.HPLC法測定苜蓿素的表觀油水分配系數[J].藥物分析雜志，2011，31（9）：1815-1817.

[10]Alfred B，Donald J，Abraham.Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery[M].New York：Wiley-Interscience，2003：249.