溫石棉及其代用纖維對鼠細胞EGFR及Survivin表達的影響

鄧麗娟 王洪州▲ 王利民 董發勤

1.四川綿陽四〇四醫院 川北醫學院附屬第二醫院呼吸內科，四川綿陽 621000；2.西南科技大學校長辦公室，四川綿陽 621000

國際上對溫石棉的生物安全性存在較大爭議[1-2]，一些學者認為溫石棉的毒性和溫石棉所帶金屬離子、表面電荷、產地等性質有較大關系。另一些學者認為溫石棉的代用纖維也能夠引起慢性肺炎，并且發現巖棉纖維可引起基因突變。也有學者認為溫石棉與煙溶液聯合對人胚肺細胞DNA的損傷具有協同作用[3-6]。由此可見溫石棉的代用纖維對人體可能也不安全。本研究利用免疫組化的方法檢測腫瘤基因表達，一方面擬證實其毒性，另一方面探討其致癌的部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源

中國倉鼠肺細胞 （Chinese hamster lung cell，V79細胞）購買自四川大學華西醫學中心生物醫學實驗室。

1.1.2 材料與試劑

溫石棉、四川新康溫石棉、陜西陜南溫石棉、玻璃纖維、陶瓷纖維、硅灰石、巖棉來自四川西南科技大學實驗室。兔抗鼠EGFR、Survivin單克隆抗體購于武漢博士德公司。免疫組化SABC試劑盒（SA1022）購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實驗組粉體及其懸液

將各實驗原礦處理成5 μm左右長，具體方法：將實驗原礦反復碾壓、劈分、剪短后，然后再進行細研磨，之后進行篩選過濾；然后烘干，最后研磨成更細的粉體。電鏡圖片見圖1。用高溫殺菌消毒各種實驗粉體，配置成 6 個不同濃度：1、2、4、6、8、10 mg/L。

圖1 溫石棉及其代用品粉體的掃描電鏡圖

1.2.2 免疫組織化學檢測腫瘤基因EGFR及Survivin的表達

1.2.2.1 實驗分組 實驗共分為7組，實驗組包括四川新康溫石棉組（A組）、陜西陜南溫石棉組（B組）、玻璃纖維組（C組）、陶瓷纖維組（D組）、硅灰石組（E組）、巖棉組（F組），并設陰性對照組（G 組）。

1.2.2.2 干預及檢測方法 預先將處理后的蓋玻片放入6孔板里，將細胞接種到蓋玻片上，細胞量為2×105/孔。將調整好的細胞懸液1 mL，分別加入到培養板各孔中。然后把接種到培養板的細胞放入到CO2細胞培養箱中培養24 h。將6種粉體6個不同濃度（1、2、4、6、8、10 mg/L） 的懸液分別取 1 mL 滴到各細胞培養孔中。將染毒的細胞放到CO2細胞培養箱中繼續培養48 h后進行免疫組化檢測。設陰性對照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。Survivin以及EGFR的免疫組織化學染色根據SABC法進行，其主要步驟如下：①將染毒的細胞放到CO2細胞培養箱中繼續培養48 h后，吸盡6孔板培養皿中的培養液，滴入丙酮處理30 min，吸盡每孔中的丙酮，蒸餾水沖洗3次。②30%的H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗3次。③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀釋度為 1∶200，37℃下孵育 60 min， 然后置 4℃冰箱過夜。⑤室溫下復溫 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）沖洗 5 min×3次。⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6） 洗 2 min×3 次。 ⑦滴加試劑 SABC，37℃20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 5 min×4 次。⑧新鮮配制的DAB溶液顯色5 min。⑨自來水沖洗后蘇木素復染，常規脫水封片。

1.2.2.3 免疫組化染色結果判斷及分析 陽性結果判斷標準為細胞漿、細胞膜或胞核呈棕黃色。倒置顯微鏡下隨機選取 3個視野（10×40），用 Image-ProPlus專業圖像分析系統檢測其平均光密度值（OD）值，再進行統計學分析處理。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各實驗組及陰性對照組的免疫組化染色結果見圖2～5，OD 值測定結果見表1～2。 EGFR、Survivin 在陰性對照組未見表達 （圖4、5）；Survivin的陽性表達主要在細胞漿，細胞膜和細胞核有少量表達；EGFR的表達主要分布于V79細胞的細胞漿，在細胞核亦有少量表達。不同濃度溫石棉及其代用品粉體懸液染毒 V79細胞后，A組及 B組與其他組比較，EGFR、Survivin的表達最強，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組與B組相比較，EGFR、Survivin的表達差異無統計學意義 （P＞0.05）；各組隨粉體濃度增加，EGFR、Survivin的表達均逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05），呈現濃度依賴性。

圖2 EGFR在陜西陜南溫石棉組中的表達（10×20）

圖3 Survivin在四川新康溫石棉組中的表達（10×20）

表1 Survivin在各組 V79細胞中的表達（±s）

表1 Survivin在各組 V79細胞中的表達（±s）

注：“-”代表不表達

組別 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A組0.381±0.0070.413±0.0080.436±0.0090.473±0.0090.529±0.0060.593±0.009 B組0.390±0.0080.415±0.0070.439±0.0080.478±0.0060.537±0.0100.618±0.008 C組0.324±0.0090.365±0.0060.399±0.0050.428±0.0060.487±0.0080.549±0.006 D組0.288±0.0050.328±0.0060.365±0.0070.396±0.0040.445±0.0090.499±0.008 E組0.199±0.0070.269±0.0050.316±0.0060.355±0.0070.409±0.0090.458±0.008 F組0.099±0.0060.116±0.0050.158±0.0070.198±0.0060.229±0.0080.268±0.012 G組------

表2 EGFR在各組V79細胞中的表達（±s）

表2 EGFR在各組V79細胞中的表達（±s）

注：“-”代表不表達

組別 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A組0.349±0.0060.399±0.0080.438±0.0080.478±0.0080.528±0.0070.588±0.018 B組0.348±0.0080.408±0.0080.448±0.0080.485±0.0070.529±0.0170.609±0.007 C組0.318±0.0070.359±0.0060.395±0.0050.427±0.0060.479±0.0080.528±0.006 D組0.269±0.0060.305±0.0040.348±0.0050.399±0.0040.438±0.0100.489±0.006 E組0.179±0.0040.238±0.0080.287±0.0050.328±0.0070.381±0.0050.439±0.007 F組0.070±0.0040.125±0.0050.169±0.0040.205±0.0090.248±0.0080.289±0.019 G組------

圖4 EGFR在陰性對照組中呈陰性表達（10×20）

圖5 Survivin在陰性對照組中呈陰性表達（10×40）

3 討論

EGFR屬于表皮生長因子家族（erbB家族），該家族包括 EGFR、C-erb-2、C-erb-3、C-erb-4。 EGFR 是原癌基因C-erb的表達產物，具有酪氨酸激酶活性，分子量為170 kD，由上千個氨基酸殘基組成。EGFR過度激活使其介導的信道環節受到影響，抑制凋亡，促進腫瘤血管生成，EGFR在很多腫瘤中均有明顯的過表達，尤其在肺癌中的表達高達53.1%～69.7%[7-9]。

Survivin具有調節細胞分裂的和抑制細胞凋亡兩種功能，是眾多凋亡抑制蛋白中分子量最小的，它的表達產物是目前學術界認為最強的凋亡抑制蛋白。Survivin抗凋亡作用既通過與紡錘體纖維結合，間接抑制caspase對紡錘體的水解作用，有利于保護有絲分裂細胞器的完整性，抑制細胞凋亡；通過阻斷線粒體細胞色素c釋放，直接抑制凋亡效應因子，使其活性消失[10-11]。

從本實驗結果可以看出，不同濃度溫石棉及代用品粉體處理V79細胞可使細胞受損，從而誘導上皮細胞EGFR、Survivin基因表達的上調，隨著暴露濃度的增加，EGFR、Survivin的表達呈進一步上調趨勢。由此可見，溫石棉及其代用品具有潛在致癌性，其部分機制可能為上調腫瘤基因EGFR和Survivin的表達，進而誘發細胞癌變。但是，從實驗本身來說，還存在兩方面的問題：首先，樣本量并不很足，每組數據使用3次實驗測定結果取平均值。其次，溫石棉以及其代用品的如何影響EGFR、Survivin的表達、通過什么物質進行影響、影響通道是什么還需要進一步考察。筆者認為，在后期的試驗中，應適當增加A組以及B組的樣本量，仔細考察溫石棉以及其代用品對于EGFR、Survivin的作用途徑。但是，總的來說，本文為后期實驗做出了鋪墊作用，通過本文實驗數據分析，溫石棉及其代用纖維對于與鼠細胞EGFR及Survivin表達有顯著的增強作用。

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