慢性腎病對大鼠骨折愈合的早期影響

趙 波 楊惠林 吳志良 張志剛

蘇州大學附屬第一醫院骨科，江蘇蘇州 215006

慢性腎病是指持續3個月以上的慢性腎損害或腎功能下降。當前慢性腎病已成為嚴重的公共健康問題，流行病學調查顯示我國成年人群中慢性腎病發病率高達10.8%[1]。由于慢性腎病可引起礦物質代謝紊亂、繼發性甲狀旁腺功能亢進及內分泌紊亂等，患者常合并腎性骨營養不良，導致骨量的丟失及骨強度的下降，骨折風險顯著增加。目前的研究熱點主要在慢性腎病患者骨折的危險因素及骨折預防方面，然而慢性腎病對骨折愈合的影響尚不十分清楚。因此，本研究應用慢性腎病大鼠脛骨骨折模型，研究慢性腎病對大鼠骨折愈合質量的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

2個月齡雄性SD大鼠40只，體重200 g左右，由蘇州大學實驗動物中心提供。適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為對照組與實驗組，每組20只。實驗組給予含0.75%腺嘌呤（SIGMA公司提供）飼料飼養，對照組予以普通飼料喂養。4周后，頸靜脈抽血檢測血清肌酐、尿素氮、鈣、磷及甲狀旁腺激素（PTH）水平，確定腎病造模成功，然后行右脛骨中段骨折造模及內固定。具體方法為：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，右后肢硫化鈉脫毛、安爾碘消毒，于右小腿中段前方做縱形皮膚切口，長約1 cm，暴露脛骨中段，環形剝離部分骨膜，用微型鋸于脛骨結節下方約1 cm處橫行鋸斷脛骨干，1 mm克氏針髓腔內固定，生理鹽水沖洗傷口后，1號絲線分層縫合切口，腹腔注射青霉素10萬U。兩組大鼠術后均給予普通飼料喂養，自由飲水。骨折造模4周后，過量麻醉處死動物，切取右側脛骨，拔除內固定，剔除軟組織，4%多聚甲醛固定，-20℃冷凍備用。

1.2 Micro CT分析

標本室溫下解凍后，采用Skyscan 1176 Micro CT（蘇州大學骨科研究所）進行標本全長掃描，層間距18 μm，掃描電壓50 kV，電流200 mA。掃描完成后將數據傳輸到圖形工作站，應用Micro CT分析軟件進行圖像重建及3D分析。在CT掃描定位圖上，以骨折線為中心，選取上下各100個掃描層面（共3.6 mm）進行骨痂形態學分析，應用線性插值方法，手動描繪出每個掃描層面的骨痂組織邊界，分析參數包括組織總量（total bone volume，TV）、骨量（bone volume，BV）和骨體積分數（BV/TV）。

1.3 生物力學測量

完成 Micro-CT掃描后，應用Instron E10000型力學試驗機（蘇州大學骨科研究所）進行三點彎曲試驗。測量時保持標本位置一直，承載點寬度20 mm，加載點為骨折部位，加載速度2.5 mm/min，記錄力-變形曲線，測試標本的最大載荷、強度、能量吸收。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及甲狀旁腺激素的變化

給予含0.75%腺嘌呤飼料喂養4周后，實驗組大鼠腎臟腫大、蒼白、包膜下見黃褐色顆粒狀；血清磷、肌酐、尿素氮、PTH均較對照組明顯升高（P＜0.05）；但血清鈣離子濃度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及PTH的變化（±s）

表1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及PTH的變化（±s）

注：PTH：甲狀旁腺激素

組別 只數 鈣（mmol/L）磷（mmol/L）肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）PTH（ng/L）對照組實驗組20 20 t值 P值2.22±0.22 2.03±0.21 1.88＞0.05 2.57±0.36 5.96±0.79 12.31＜0.05 23.55±2.92 227.07±51.41 12.49＜0.01 4.56±0.35 46.41±7.67 17.22＜0.01 111.20±8.14 1268.50±65.36 22.66＜0.01

2.2 Micro CT分析

骨折造模術后4周，兩組大鼠骨折均無明顯的畸形愈合，無內固定彎曲、斷裂等，去除內固定后無骨折部位無肉眼可見的活動及成角。Micro CT掃描二維及三位圖像重建顯示，對照組骨折斷端有連續的骨性骨痂連接；實驗組骨折斷端以軟骨痂為主，骨性骨痂不連續（圖1）。骨痂組織3D分析結果顯示，實驗組BV、TV、BV/TV也較對照組明顯降低（P ＜ 0.05）。 見表2。

表2 骨痂組織Micro CT分析（±s）

表2 骨痂組織Micro CT分析（±s）

注：TV：骨痂組織總量；BV：骨性骨痂量；BV/TV：骨體積分數

組別 只數 TV（mm3）BV（mm3） BV/TV（%）實驗組對照組t值P值20 20 18.45±2.11 29.60±2.45 18.21＜0.01 7.12±3.40 15.65±1.32 8.43＜0.01 40.77±2.27 44.65±2.12 2.40＜0.01

2.3 生物力學

在三點彎曲力學測試中，所有標本均于骨痂組織處斷裂。實驗組標本最大載荷、強度、斷裂能量均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三點彎曲力學測試結果（±s）

表3 三點彎曲力學測試結果（±s）

組別 只數 最大載荷（N） 強度（N/mm） 斷裂能量（N·mm）實驗組對照組20 20 t值 P值34.85±9.39 46.42±3.26 4.76＜0.01 47.65±5.64 103.79±4.12 3.23＜0.01 7.17±4.47 14.25±2.21 9.61＜0.01

3 討論

最新的流行病學資料顯示，我國慢性腎病患者已超過一億[1]，是世界上慢性腎病患者最多的國家。慢性腎病引起礦物質代謝紊亂、繼發性甲狀旁腺功能亢進、活性維生素D3缺乏，嚴重影響骨代謝，造成患者骨量減少、骨強度下降，骨折風險顯著增加。研究發現慢性腎病患者骨折風險隨著腎小球率過濾的下降而增加[2]，終末期慢性腎病患者髖部骨折風險是正常人群的4倍[3]。由于慢性腎病在老年人群的發病率最高[4]，老年患者常合并絕經后骨質疏松及老年性骨質疏松，因此骨折風險進一步增加。當前國內外的研究熱點主要在慢性腎病患者的骨折風險及預防方面，而慢性腎病對骨折愈合的影響尚不是很清楚。

常用于建立大鼠慢性腎病模型的方法的有部分腎切除、單側腎動脈結扎+對側部分腎切除、腎毒性藥物等。Terai等[5]對比研究了部分腎切除及腺嘌呤飼養法，認為應用腺嘌呤喂養建立大鼠慢性腎病模型具有快速、穩定、病死率低等優點。本研究應用含0.75%腺嘌呤飼料喂養的方法建立大鼠的慢性腎病模型，在給藥4周后，觀察到血清肌酐、尿素、磷的顯著升高，肉眼觀察大鼠腎臟腫大、蒼白、腎臟表面可見黃褐色顆粒，符合慢性腎病的病理改變。

Micro CT具有極高的分辨率，能清楚顯示骨組織內部結構，通過圖像重建技術及3D形態學分析，可準確反映骨折愈合情況及骨痂微細結構的變化，具有普通X線攝片無法比擬的優勢。本研究觀察到在骨折后第4周，實驗組大鼠骨折部位沒有連續性的骨性骨痂形成，骨痂內非礦化成分較多；而對照組大鼠骨折線消失，骨折斷端骨痂組織連續，骨痂改建較好。3D分析顯示，實驗組大鼠TV、BV、BV/TV均較對照組下降，表明在骨折愈合早期，實驗組大鼠骨折愈合過程中成骨能力下降、骨痂礦化延遲。

生物力學測試是評價骨折愈合質量的金標準。由于實驗組大鼠骨痂組織以非礦化的軟骨痂為主，其力學性能較差，三點彎曲力學測試發現其最大載荷、強度及能量吸收較對照組分別下降了24.9%、54.5%、49.7%。

骨折愈合是一個復雜的過程，由于參與骨折愈合的組織細胞對應變的耐受能力不同，在骨折愈合的不同階段，有其特殊的組織細胞反應。在骨折愈合初期，骨折部位應變較大，主要由能耐受高應變的肉芽組織及軟骨修復；當局部應變小于1%的時候，成骨細胞開始活動，局部形成編織骨替代軟骨痂；在骨折愈合的后期，破骨細胞開始活躍，編織骨及礦化軟骨逐漸被吸收，取而代之的是排列規整的板層骨。成骨細胞及破骨細胞的功能與活性是影響骨折愈合的重要因素，任何原因造成骨折愈合過程中成骨減少或骨吸收增加都會影響骨折愈合過程中骨痂的質量。

慢性腎病可通過多種機制影響骨折愈合質量。繼發性甲狀旁腺功能亢進（SHPT）可能是影響骨折愈合的重要原因之一。本研究發現，大鼠給予含腺嘌呤飼料喂養4周后，血清PTH濃度升高到正常的10倍以上。研究發現，PTH對成骨細胞分化具有雙重作用，間歇性地給予PTH可促進其分化，而持續性給予PTH則對成骨細胞的分化產生抑制作用[6]。同時，成骨細胞對PTH的抵抗可能是成骨細胞活性下降的另一重要原因，慢性腎功能不全時成骨細胞表達PTH1型受體下調[7]，PTH抵抗可能是SHPT的重要原因[8]，在慢性腎病的患者，PTH需要升高到正常的2～4倍才能維持正常的骨代謝[9]。成骨細胞在骨折愈合過程的主要功能是合成、分泌骨基質及促進類骨質礦化。持續性的高水平PTH勢必導致成骨細胞分化障礙，影響骨折愈合。此外，血液中高濃度的PTH可促進破骨細胞分化因子（RANKL）的表達，RANKL與破骨細胞前體細胞膜上的核因子-κB受體活化因子（RANK）結合，啟動細胞內信號轉導，引起級聯反應，促進破骨細胞分化、活化，抑制破骨細胞的凋亡[10]。近年來發現破骨細胞本身也表達PTH1型受體，在體外單獨培養的破骨細胞中，PTH通過直接作用于破骨細胞促進其骨吸收活性[11]。成骨細胞與破骨細胞的功能失衡，導致骨折愈合過程中新骨生成的減少、吸收增加及礦化障礙，最終導致骨痂量的減少和機械強度下降。另外，慢性腎病引起的鈣磷代謝紊亂、腎性貧血、低蛋白血癥、性腺功能低下、代謝性酸中毒、鋁中毒等可能同樣會對骨折愈合過程產生不良影響。

總之，本研究應用慢性腎病大鼠骨折模型，通過生物力學測試及Micro CT分析等方法，首次觀察到慢性腎病大鼠骨折愈合過程中骨痂質量及力學性能的下降，從而影響骨折愈合質量。然而慢性腎病影響大鼠骨折愈合的細胞、分子機制尚不清楚，其對骨折愈合中、晚期的影響也有待進一步研究。

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