組蛋白去乙酰基酶在前列腺癌中的作用及機(jī)制研究

黃 勇 閆 駿 馬 敏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

前列腺癌是一種常見于老年男性的惡性腫瘤，在歐美等地發(fā)病率位居惡性腫瘤首位[1]。組蛋白修飾是組織細(xì)胞發(fā)育、分化基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵分子機(jī)制，組蛋白修飾狀態(tài)改變?cè)谀[瘤發(fā)生及進(jìn)展中具有重要作用。組蛋白修飾方式包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化修飾等[2－4]，核心組蛋白乙酰化水平的穩(wěn)態(tài)是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰化酶（HDACs）之間的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)的[5]。HDACs在許多異常活化的癌細(xì)胞中均存在，可阻抑細(xì)胞周期抑制因子的作用。組蛋白乙酰化狀態(tài)失衡參與眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，是細(xì)胞癌變中重要的轉(zhuǎn)錄后修飾過程[6]。因此，HDAC是重要的抗癌藥物靶點(diǎn)，在抗癌藥物研究中具有重要意義[6]。

丙戊酸（VPA）是一種HDAC抑制劑（HDACI）和抗癲癇藥物，可抑制Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HDACs）[7]。研究發(fā)現(xiàn)，長期服用VPA可減少前列腺癌癥細(xì)胞的增殖[8－10]。因此，本研究觀察了HDAC抑制劑VPA對(duì)在體前列腺癌移植體的作用，以期明確組蛋白去乙酰基酶在前列腺癌中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌的細(xì)胞系LNCaP購自American Type Culture Collection（Manassas，VA），雄性無胸腺 nu/nu 小鼠（20～25 g）購自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。L－谷氨酰胺的 RPMI 1640 培養(yǎng)基為 Cellgro（Herndon，VA）公司產(chǎn)品，熱滅活胎牛血清購自 Life Technologies，Inc.（Carlsbad，CA），鹽酸環(huán)丙沙星和慶大霉素購自US Biological公司（Swampscott，MA），基底膠為 BD Biosciences（Palo Alto，CA）公司產(chǎn)品，VPA（1 mol/L 的 VPA 鈉鹽；Sigma，St.Louis，MO）。

一抗來源：乙酰化組蛋白H3為美國Upstate公司產(chǎn)品，p21WAF1/CIP1及雄激素受體（AR）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，細(xì)胞周期蛋白D1為美國Ventana Medical Systems公司產(chǎn)品，p27KIP1為美國DAKO公司產(chǎn)品。

主要儀器：Leica CM 1850冰凍切片機(jī)為德國徠卡公司產(chǎn)品，Olympus BX51顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)及移植瘤建立

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境：含L－谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，10%熱滅活胎牛血清，5 μg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星和50 μg/mL慶大霉素。細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)基80%～90%時(shí)，用含0.05%胰蛋白酶的EDTA（0.53 mmol/L）收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸在PBS（pH 7.4），與混合 1×基底膠（BD Biosciences，Palo Alto，CA）混勻，皮下注入（1×106/次）雄性無胸腺nu/nu小鼠，建立腫瘤移植體。

1.3 動(dòng)物分組及處理

移植瘤建立后，動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組和HDAC抑制劑組，每組6只。HDAC抑制劑VPA溶于PBS，經(jīng)0.22 μm過濾器滅菌，HDAC抑制劑組受試動(dòng)物接受0.4%w/v的VPA飲用水，對(duì)照組為不含VPA正常飲用水，35 d后切除腫瘤。

1.4 免疫組化染色

切除腫瘤移植體經(jīng)福爾馬林液固定，組織塊依次浸入10%、20%、30%的蔗糖溶液脫水，然后經(jīng)OCT包埋，行連續(xù)冠狀恒冷箱切片，厚度16 μm，組織切片經(jīng)水化后，3%的過氧化氫孵育 10 min，PBS沖洗（3 min×3次），滴加馬血清封閉液，孵育10 min，一抗4℃孵育過夜（一抗使用濃度：乙酰化組蛋白 H3 為 1∶1000，p21WAF1/CIP1為 1∶500，細(xì)胞周期蛋白 D1 為 1∶1000，p27KIP1為 1∶1000，AR 為 1∶250），37℃復(fù)溫45 min，PBS洗 5 min×3 次，滴加相應(yīng)二抗，37℃孵育 45 min，PBS沖洗，5 min×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件陽性細(xì)胞進(jìn)行平均光密度（MOD）分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制HDAC對(duì)前列腺癌移植體組蛋白H3乙酰化的影響

給予VPA飲水后，腫瘤移植體乙酰化組蛋白H3與未處理的對(duì)照組相比，陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯增加，乙酰化組蛋白H3水平顯著升高（P＜0.05），表明抑制HDAC可提高乙酰化組蛋白H3的表達(dá)。見圖1、表1。

2.2 抑制HDAC對(duì)前列腺癌移植體細(xì)胞周期的影響

免疫組化檢測結(jié)果表明：給予組蛋白乙酰化酶抑制劑VPA后，前列腺癌移植體細(xì)胞p21WAF1/CIP1水平顯著升高（P＜0.05，圖2、表1），提示細(xì)胞周期被有效阻滯；進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1及p27KIP1的檢測結(jié)果顯示，HDAC抑制劑組D1蛋白水平與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05，圖2、表1），而p27KIP1表達(dá)水平則比對(duì)照組明顯增加（P＜0.05，圖2、表1），這進(jìn)一步提示，抑制HDAC可明顯阻滯細(xì)胞周期，抑制癌細(xì)胞生長。

2.3 抑制HDAC對(duì)前列腺癌移植體AR表達(dá)的影響

AR是雄激素作用的中介，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，給予組蛋白乙酰化酶抑制劑VPA后，前列腺癌移植體細(xì)胞AR的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05，圖3、表1），提示抑制HDAC可通過阻斷雄激素的作用途徑抑制前列腺癌細(xì)胞發(fā)展。

表1 抑制HDAC對(duì)前列腺癌移植體各標(biāo)志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

表1 抑制HDAC對(duì)前列腺癌移植體各標(biāo)志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

注：AR：雄激素受體

組別 H3 P21WAF1/CIP1P27KIP1細(xì)胞周期蛋白D1 AR對(duì)照組HDAC抑制劑組P值0.63±0.12 0.75±0.11 0.27±0.06 0.79±0.10 0.31±0.08 1.09±0.18 0.69±0.09 0.58±0.08 0.62±0.10 0.53±0.07 0.0360.0250.020.0430.046

3 討論

以HDAC為抑制靶標(biāo)的藥物可重新激活沉默的腫瘤抑制基因，并具有選擇性、多效性的抗腫瘤作用[11]。大部分人類癌癥高度異質(zhì)性，可能涉及許多不同的信號(hào)通路。體外和在體研究表明，HDACI可抑制多種活性[12-14]，長期服用HDAC抑制劑VPA可顯著減少前列腺癌細(xì)胞增殖，腫瘤體積明顯減小[8]。為了進(jìn)一步探討HDAC在前列腺癌作用及機(jī)制，筆者研究了HDACI對(duì)異種移植前列腺癌細(xì)胞周期和增殖相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響。

細(xì)胞周期由周期蛋白和周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）的相互作用而完成。 P21WAF1/CIP1是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKI） 家族的一員，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中p21WAF1/CIP1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期阻滯起重要作用[15]，其可通過抑制Cyclin-CDK2復(fù)合體的活性及阻斷DNA復(fù)制阻滯細(xì)胞周期[16]。p27KIP1同樣被證實(shí)在阻滯G1期到S期細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果證實(shí)，抑制HDAC可促進(jìn)前列腺癌移植體細(xì)胞p21WAF1/CIP1和p27KIP1表達(dá)，表明HDAC與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白密切相關(guān)，通過抑制HDAC而上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子的表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞增殖。

Cyclin D1是G1～S細(xì)胞周期進(jìn)程中重要的正向調(diào)控因子，其可通過與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合體而激活后者，進(jìn)而使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制基因失活，加速癌細(xì)胞周期進(jìn)程[18-19]。在多種腫瘤組織中，均發(fā)現(xiàn)Cyclin D1高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，抑制HDAC可降低前列腺癌移植體細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)水平，這可能是HDACI抑制癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

前列腺癌的生長是雄激素依賴性的，AR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，AR高表達(dá)可增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)低水平雄激素的敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌在抗雄激素治療一段時(shí)間后，大多數(shù)最終發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌[20-22]。本研究表明，抑制HDAC可下調(diào)前列腺癌移植體細(xì)胞AR表達(dá)水平，這提示HDACI可通過AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制癌細(xì)胞生長。

綜上，HDAC參與前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控并與AR過表達(dá)有關(guān)，HDACI可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯及下調(diào)AR表達(dá)水平等機(jī)制抑制前列腺癌腫瘤移植體生長，HDAC可作為前列腺癌治療藥物的研制靶標(biāo)。

[1]Suikki HE，Kujala PM，Tammela TL，et al.Genetic altera tions and changes in expression of histone demethylases in prostate cancer[J].Prostate，2010，70（8）：887-898.

[2]Secombe J，Eisenman RN.The function and regulation of the JARID1 family of histone H3 lysine 4 demethylases：the Myc connection[J].Cell Cycle，2007，6（11）：1324-1328.

[3]Blair LP，Cao J，Zou MR，et al.Epigenetic regulation by lysine demet hylase 5（KDM5）enzymes in cancer[J].Cancers（Base1），2011，3（1）：1383-1404.

[4]孫圣坤，于曉妉，史立新，等.組蛋白去乙酰化酶抑制劑FK228對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞抑制效應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路研究[J].現(xiàn)代泌尿生殖和腫瘤雜志，2009，1（1）：32-33.

[5]Rephaeli A，Blank-Porat D，Tarasenko N，et al.In vivo and in vitro antitumor activity of butyroyloxymethyl-diethylphosphate（AN-7），a histone deacetylase inhibitor，in human prostate cancer[J].Int J Cancer，2005，116（2）：226-235.

[6]Konstantinopoulos PA，Karamouzis MV，Papavassiliou AG.Focus on acetylation：the role of histone deacetylase inhibitors in cancer therapy and beyond[J].Expert Opin Invest Drugs，2007，16（5）：569-571.

[7]Gottlicher M，Minucci S，Zhu P，et al.Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells[J].EMBO J，2002，20（24）：6969–6978.

[8]Xia Q，Sung J，Chowdhury W，et al.Chronic administration of valproic acid inhibits prostate cancer cell growth in vitro and in vivo[J].Cancer Res，2006，66（4）：7237–7244.

[9]Shabbeer S，Kortenhorst MSQ，Kachhap S，et al.Multiplemolecular path ways explain the anti-proliferative effect of valproic acid on prostate cancer cells in vitro and in vivo[J].Prostate，2007，6（10）：1099-1110.

[10]Chen CL，Sung J，Cohen M，et al.Valproic acid inhibits invasiveness in bladder cancer but not in prostate cancer cells[J].J Pharmacology Exp Therap，2006，319（2）：533–542.

[11]Rosato RR，Grant S.Histone deacetylase inhibitors：insights intome chanisms of lethality[J].Expert Opin Therapeutic Targets，2005，9（4）：809-824.

[12]Sambucetti LC，F(xiàn)ischer DD，Zabludoff S，et al.Histone deacetylase inhibition selectively alters the activity and expression of cell cycle proteins leading to specific chromatin acetylation and antiproliferative effects[J].J Biolo Chem，1999，274（49）：34940-34947.

[13]Iwata S，Saito T，Ito Y，et al.Antitumor activities of valproic acid on Epstein-Barr virus-associated T and natural killer lymphoma cells[J].Cancer Sci，2012，103（2）：375-381.

[14]Kuendgen A，Gattermann N.Valproic acid for the treatment of myeloid malignancies[J].Cancer，2007，110（5）：943-954.

[15]Elledge SJ，Winston J，Harper JW.A question of balance： the role of cyclin-kinase inhibitors in development and tumorigenesis[J].Trends Cell Biol，1996，6（3）：388-392.

[16]Ocker M，Schneider-Stock R.Histone deacetylase inhibitors：signalling towards p21cip1/waf1[J].Int J Biochem Cell Biology，2007，39（7-8）：1367-1374.

[17]Li W，Sanki A，Karim RZ，et al.The role of cell cycle regulatory proteins in the pathogenesis of melanoma[J].Pathology，2006，38（4）：287-301.

[18]Bartek J，Bartkova J，Lukas J.The retinoblastoma protein pathway and the restriction point[J].Curr Opin Cell Biol，1996，8（6）：805-814.

[19]Parry D，Mahony D，Wills K，et al.Cyclin DCDK subunit arrangement is dependent on the availability of competing INK4 and p21 class inhibitors[J].Mol Cell Biol，1999，19（3）：1775-1783.

[20]Isaacs JT，Isaacs WB.Androgen receptor outwits prostate cancer drugs[J].Nat Med，2004，10（1）：26-27.

[21]Loriot Y，Zouheidi A，Gleave ME.Targeted therapies in m etastatic castration-resistant prostate cancer：beyond the androgen receptor[J].Urol Clin North Am，2012，39（4）：517-531.

[22]Kahl P，Gullotti I，Heukamp LC，et al.Androgen receptor coactivators lysine-specific histone demethylase 1 and four and a half IAM domain protein 2 predict risk of prostate cancer recurrence[J].Cancer Res，2006，66（23）：11341-11347.