米格列奈對內皮細胞一氧化氮合成及氧化應激的影響

蔣曦媛 陸玉鳳 劉麗艷 余江毅

1.南京中醫藥大學附屬昆山市中醫醫院內分泌科，江蘇昆山 215300；2.江蘇省中醫院 南京中醫藥大學附屬醫院內分泌科，江蘇南京 210029

米格列奈于1992年由Sato等首次合成，是繼瑞格列奈和那格列奈后的第3個新型苯甲酸衍生物類降糖藥[1]。其不僅具有速效、強效、短效降糖的特點，同時還有改善胰島素抵抗、抗炎及抗氧化應激等作用[2－3]。有研究表明，糖尿病慢性并發癥的發生與血管內皮功能紊亂關系密切[4]。本研究通過觀察米格列奈對高糖環境下內皮細胞一氧化氮（NO）合成及氧化應激的影響，從而進一步探討米格列奈對高糖環境下人主動脈內皮細胞（HAEC）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HAEC及內皮細胞培養基購自于美國ScienCell研究實驗室（ScienCell 6100）。胎牛血清購自于杭州四季青生物工程材料研究所。人NO、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒購自于美國R and D公司。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對照組（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、高糖組（葡萄糖濃度為30 mmol/L）、米格列奈組（30 mmol/L葡萄糖濃度+10 μmol/L米格列奈）。

1.2.2 細胞培養HAEC在含10%胎牛血清的培養瓶中常規培養，條件為：5%CO237℃。在HAECs達80%左右融合時用含2%馬血清的DMEM培養液誘導分化成為成熟HAEC。

1.2.3 一氧化氮及一氧化氮合酶測定 按說明書制成濃度分為 12.5、25、50、100、200 μmol/L 的標準品稀釋液，分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔加入稀釋好的標準液50 μL；在酶標包被板上待測樣品孔內先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。輕輕晃動混勻，37℃溫育30 min。棄液甩干后每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。輕輕晃動搖勻，37℃溫育30 min。再次棄液甩干，加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。取出酶標板，每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔調零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。根據標準曲線計算出對應樣品濃度。

1.2.4 超氧化物歧化酶的檢測 取細胞培養液，3500 r/min離心10min，取上清0.1 mL待測。按照說明書要求加入0.1 mL試劑1搖動幾下試管，再加入試劑2、3、4各0.1 mL，混勻，塑料薄膜封口，刺一小孔，37℃水浴40 min，加入顯色劑1 mL，混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值，根據公式計算SOD活力。

1.2.5 丙二醛的檢測 取培養液，3500 r/min離心10 min，取上清0.05 mL待測。按照說明書要求加入0.05 mL試劑1搖動幾下試管，再加入0.75 mL試劑2及0.25 mL試劑3，混勻，塑料薄膜封口，刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻。再次3500 r/min離心10 min，取上清液，532 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值，根據公式計算上清液中MDA含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，采用 one－way ANOVA 進行顯著性檢驗，組間比較采用S-N-K檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物干預HAECs不同時間NO的變化

以濃度為5.5 mmol/L及30 mmol/L的葡萄糖、30 mmol/L的葡萄糖+10 μmol/L的米格列奈干預HAECs，收集培養24、48、72 h的細胞上清液，ELISA法測定NO的含量。結果顯示，與對照組相比，高糖組24 h NO檢測值增高，且差異有統計學意義（P＜0.05），之后隨著時間延長，NO含量明顯減少（P＜0.05）。與高糖組相比，米格列奈組24 h NO含量降低，之后增高，48 h及72 h NO含量較高糖組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 米格列奈對人主動脈細胞培養上清液中一氧化氮含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表1 米格列奈對人主動脈細胞培養上清液中一氧化氮含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組高糖組米格列奈組245.64±3.53 289.76±4.50a 232.71±8.78ab 244.40±4.53 228.04±5.53a 263.48±6.32ab 240.19±7.47 219.25±4.91a 270.91±6.03ab

2.2 藥物干預HAEC不同時間細胞上清液eNOS含量的變化

收集培養24、48、72 h的上清液，ELISA法測定eNOS的含量。結果顯示，與對照組相比，高糖組eNOS含量持續降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與高糖組相比，米格列奈組在各時間點eNOS含量均顯著性增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 米格列奈對人主動脈細胞培養上清液中內皮型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表2 米格列奈對人主動脈細胞培養上清液中內皮型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組高糖組米格列奈組49.13±3.21 46.27±3.91a 51.96±2.65ab 44.73±3.15 41.06±3.04a 59.28±3.63ab 45.63±4.05 39.73±3.27a 60.41±4.48ab

2.3 藥物干預HAEC不同時間細胞上清液iNOS含量的變化

收集培養24、48及72 h的上清液，ELISA法測定iNOS的含量。結果顯示，與對照組相比，高糖組iNOS含量增高，差異有統計學意義（P＜0.05），其中以24 h增高最明顯。與高糖組相比，米格列奈組iNOS含量在各時間點均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 米格列奈對人主動脈內皮細胞上清液中誘導型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表3 米格列奈對人主動脈內皮細胞上清液中誘導型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組高糖組米格列奈組63.89±3.20 79.81±3.21a 53.28±3.45ab 65.47±4.25 69.36±4.27a 62.09±3.71ab 63.13±5.13 66.87±4.28a 59.90±3.60ab

2.4 藥物干預HAEC不同時間上清液中SOD活力的變化

分組干預 HAEC，收集培養 6、12、24、48、72 h 的上清液，比色法測定SOD的活力。結果顯示，與對照組相比，高糖組SOD活力顯著性下降（P＜0.05）；而與高糖組相比，米格列奈組SOD活力顯著增高（P＜0.05）。見表4。

2.5 藥物干預HAEC不同時間上清液MDA含量的變化

分組干預 HAEC，收集培養 6、12、24、48、72 h 的上清液，比色法測定細胞培養上清液中MDA的含量。結果顯示，與對照組相比，高糖組MDA含量顯著性增高（P＜0.05）；與高糖組相比，米格列奈組MDA含量顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表4 干預不同時間超氧化物岐化酶活力的變化（U/mL，±s，n=5）

表4 干預不同時間超氧化物岐化酶活力的變化（U/mL，±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對照組高糖組米格列奈組2.88±0.54 2.03±0.49a 3.99±0.46ab 3.58±0.22 2.32±0.11a 5.70±0.14ab 2.44±0.21 1.58±0.09a 4.98±0.37ab 3.69±0.31 1.03±0.11a 3.18±0.25b 3.90±0.22 2.34±0.19a 3.35±0.51b

表5 米格列奈對人主動脈內皮細胞上清中丙二醛含量的影響（nmol/mL，±s，n=5）

表5 米格列奈對人主動脈內皮細胞上清中丙二醛含量的影響（nmol/mL，±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對照組高糖組米格列奈組0.606±0.017 0.753±0.012a 0.500±0.014ab 0.508±0.021 0.666±0.015a 0.633±0.018ab 0.466±0.017 0.666±0.053ac 0.623±0.051ab 0.403±0.015 0.596±0.023a 0.510±0.030ab 0.400±0.013 0.583±0.017a 0.513±0.015ab

3 討論

血管內皮細胞（VEC）位于血流和組織之間，為襯貼于血管內腔面的單層扁平細胞，研究表明它不僅起屏障作用，還具有重要的內分泌功能，參與血管損傷的修復和免疫反應[5]，糖尿病并發癥的發生和血管內皮功能的紊亂密切相關[6]。NO是內皮細胞分泌最強的血管舒張因子，NOS是其合成的限速酶，靜止期的內皮細胞主要表達eNOS，催化生成低濃度的NO，用以舒張血管和抑制血小板聚集。當受到外來損傷如高糖刺激時，iNOS被激活，誘導高濃度的NO的合成，引起內皮細胞的損傷和凋亡[7]。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，自由基的產生與抗氧化防御之間嚴重失衡，從而導致組織損傷。以往研究證實，氧化應激反應與糖尿病血管并發癥及動脈粥樣硬化關系密切[8－9]。SOD能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷。MDA則是體內脂質過氧化的代表產物之一，可以間接反映細胞損傷的程度。

本研究觀察到，米格列奈組24 h NO的含量相對于高糖組是減少的，48、72 h NO的合成及釋放均較高糖組高。同時米格列奈組iNOS的含量各時間點均是減少的，說明米格列奈有效抑制了高糖對iNOS的激活，有利于減少早期iNOS激活后NO大量合成對細胞造成的傷害。而米格列奈組eNOS的含量均較高糖組增高。eNOS的激活有利于低濃度NO合成的增加，有利于糾正高糖刺激后內皮細胞功能的紊亂。同時本研究觀察到，高糖組SOD含量較對照組明顯下降，而MDA含量顯著增高，提示高糖環境下內皮細胞氧化應激反應的激活，與以往結果一致。而與高糖組相比，米格列奈組的SOD活性增高，MDA的含量明顯降低，提示米格列奈對氧化應激反應有一定的抑制作用，從而對維護正常的內皮細胞功能起到有益作用。有研究認為高糖誘發的氧化應激反應可通過激活TGF－β1/PI3K/Akt途徑誘導產生過多的iNOS[10]。同時氧化應激可使eNOS表達下降，減少NO生成，且超氧陰離子可與NO生成過硝酸根離子（OONO－），使NO失活。米格列奈對氧化應激反應的抑制，有利于減少早期高糖刺激的iNOS產生，適度增強eNOS表達，有利于糾正高糖損傷造成內皮細胞功能的紊亂，但具體機制有待進一步研究。

米格列奈作為新型的格列奈類降糖藥，多種體內外實驗均已表明其能有效降低血糖，改善糖化血紅蛋白，減少低血糖事件[11]，同樣也顯示了其在改善血脂代謝及降低炎癥因子、延緩動脈粥樣硬化等方面的優勢。報道證實米格列奈所結合的磺脲類受體于人的大動脈（冠狀動脈、主動脈等）均存在[12]，本研究觀察到其可減少高糖環境中內皮細胞iNOS的生成，增強eNOS的活性，從而適度促進內皮細胞NO的產生，同時能減輕高糖引起的氧化應激損傷，這一現象值得進一步研究。

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