以葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）為靶向的胰蛋白酶抑制劑抗腸癌效應(yīng)研究

趙 超 李宗偉 付 榮 趙亞蕊 史通麟 李卓玉

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所－化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 太原 030006）

腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的重大疾病之一。傳統(tǒng)的治療手段非選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生了較大的毒性作用和不良反應(yīng)，因此尋找新的分子靶點(diǎn)、開發(fā)高效低毒的分子靶向抗癌藥物已成為抗腫瘤研究的重要課題。

葡萄 糖 調(diào) 節(jié) 蛋 白 78（glucose－regulated protein 78，GRP78）是位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要分子伴侶蛋白。GRP78在腫瘤細(xì)胞中通常發(fā)生過表達(dá)，促進(jìn)多個(gè)腫瘤惡性特征的形成。值得關(guān)注的是，腫瘤細(xì)胞中的GRP78可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面發(fā)揮信號(hào)分子受體的功能。因此，腫瘤細(xì)胞表面GRP78蛋白可以作為腫瘤靶向治療的重要靶點(diǎn)［1］。目前，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)多肽序列可以與GRP78蛋白結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化過程，如WIFPWIQL［2］、WDLAWMFRLPVG［2］和 GIRLRG［3］。

胰蛋白酶抑制劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其在抗腫瘤方面的效應(yīng)受到研究者的廣泛關(guān)注［4－6］。綠豆胰蛋白酶抑制劑全長72個(gè)氨基酸，含有賴氨酸和精氨酸兩個(gè)活性中心［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)綠豆胰蛋白酶抑制劑賴氨酸活性中心（命名為TI），具有較高的胰蛋白酶抑制劑活性，能夠抑制大腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞遷移，但對(duì)細(xì)胞存活無顯著影響［8］。

本研究旨在通過基因工程手段構(gòu)建GRP78結(jié)合肽段WIFPWIQ與TI的融合蛋白GBP－TI表達(dá)載體，通過GST親和層析柱純化獲得GBP－TI蛋白，探討GBP－TI能夠通過細(xì)胞表面GRP78實(shí)現(xiàn)靶向抗腸癌效應(yīng)，從而為腫瘤靶向藥物的開發(fā)提供一種新的策略。

材料和方法

菌株與質(zhì)粒 E．coli DH5a、E．coli BL21和載體 p GEX－4 T－1由本室保存。重組質(zhì)粒p GEX－4 T－1－Lys GP33由中科院上海生化所戚正武教授饋贈(zèng)。

細(xì)胞系 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、DLD1、人正常肝細(xì)胞HL7702和人胚胎腎細(xì)胞HEK293由本室保存。

試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國Ther mo公司），Gl utat hione Sephar ose 4 Fast Flow （美 國 GE Healthcare公司）；BAp NA（苯甲酰－dl－Arg－P－硝基酰替苯胺鹽酸鹽，上海三杰生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）；MTT（北京索萊寶科技有限公司），GRP78和GST抗體（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

GBP－TI表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)和純化設(shè)計(jì)GBP－TI表達(dá)序列擴(kuò)增引物（圖1），以p GEX－4T－1－Lys GP33質(zhì)粒中TI表達(dá)序列為模板，PCR擴(kuò)增GBP－TI表達(dá)序列，擴(kuò)增片段與p GEX－4T－1質(zhì)粒雙酶切，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E．coli DH5α，獲得 GBP－TI原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX－4 T－1－GBP－TI。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，構(gòu)建大腸埃希菌工程菌p GEX－4T－1－GBP－TI／BL21。將該工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至D600約為0．5，加IPTG至終濃度為0．5 mmol／L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。37℃培養(yǎng)3 h后，8 000 r／min離心10 min收集菌體，懸浮于PBS緩沖液中，冰上放置。用超聲波破菌體，13 000 r／min離心10 min沉淀細(xì)胞碎片。取上清過GST親和層析柱，PBS緩沖液洗去雜蛋白，10 mmol／L還原谷胱甘肽競(jìng)爭(zhēng)洗脫目的蛋白，10%SDS－PAGE檢測(cè)目的蛋白純化效果。

圖1 GBP－TI表達(dá)序列擴(kuò)增示意圖Fig 1 Amplification schemes of GBP－TI expressed sequence

GBP－TI胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定 以BAp NA（苯甲酰－dl－Ar g－P－硝基酰替苯胺鹽酸鹽）為底物，在3 mL 緩沖液（100 mmol／L Tris－HCl，10 mmol／L Ca Cl2）中加入40μg胰蛋白酶和一定量的GBP－TI，37℃保溫5 min，加入底物 BAp NA （150 mmol／L，溶于DMSO）17μL。繼續(xù)保溫10 min，加入33%的乙酸溶液250μL，終止反應(yīng)，在410 n m波長處測(cè)定吸光度值（D）。由于胰蛋白酶可催化底物水解BAp NA，引起410 n m波長處吸光度增加，加入重組胰蛋白酶抑制劑后可使410 n m波長處吸光度減少，根據(jù)減少程度可知抑制劑的抑制活性。

細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、DLD1、人正常肝細(xì)胞HL7702和人胚胎腎細(xì)胞HEK293。細(xì)胞用含10%滅活新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

激光共聚焦檢測(cè)GBP－TI與細(xì)胞表面GRP78相互作用 將生長狀態(tài)良好的DLD1細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片上，細(xì)胞生長至50%融合時(shí)用GBP－TI處理24 h。然后PBS洗滌、免疫染色固定液固定30 min。5%BSA（PBS配制）封閉30 min。加入兔抗 GRP78的多克隆抗體（1∶200）和鼠抗GST的單克隆抗體（抗體濃度為1∶100），4℃孵育過夜，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔和TRITC標(biāo)記羊抗鼠二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，用 Ol y mpus Fl uoview FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記結(jié)果并拍攝圖像，分析熒光分子的共定位情況。

MTT法GBP－TI對(duì)細(xì)胞存活的影響 選取對(duì)數(shù)生長期的SW620、DLD1、HL7702和HEK293細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，以7 000／100μL的細(xì)胞濃度接種到96孔培養(yǎng)板。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后取出培養(yǎng)板，以濃度為0、5、10、20μmol／L的GBP－TI處理細(xì)胞48 h后，每孔加入20μL MTT（5．0 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄板中的培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO，震蕩均勻，于570 n m處測(cè)定各孔D值。

細(xì)胞核DAPI染色觀察GBP－TI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

人結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞以4×105／mL細(xì)胞密度接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入GBP－TI處理細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍攝細(xì)胞狀態(tài)變化。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，免疫染色固定液固定20 min，0．3%Triton X－100孵育10 min，DAPI染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果中的數(shù)據(jù)表達(dá)為x—±s，數(shù)據(jù)圖中用誤差棒（Err or Bar）表示標(biāo)準(zhǔn)差，單因素分析采用 Student′s t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 11．0 統(tǒng)計(jì)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

GBP－TI蛋白表達(dá)、純化及酶活力測(cè)定 將重組質(zhì)粒p GEX－4T－1－GBP－TI經(jīng)Bam H I與Xho I雙酶切鑒定，獲得了與預(yù)期大小一致的片段（圖2 A），將酶切陽性菌液送至公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因片段一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將 p GEX－4T－1－GBP－TI質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E．coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到純度較高的GBP－TI融合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為30 000，與預(yù)期大小相符（圖2B）。采用紫外吸收法測(cè)定GBP－TI的胰蛋白酶抑制劑活性，GBP－TI與GST－TI具有相當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌敢种苿┗盍Γ珿BP－TI與胰蛋白酶摩爾比在1∶4時(shí)，抑制率可達(dá)到90% 以上（圖2C），表明加入GRP78結(jié)合肽的不影響TI的胰蛋白酶抑制劑活性。

圖2 GBP－TI克隆、表達(dá)及酶活力測(cè)定Fig 2 Cloning，expression and activity deter mination of GBP－TI protein

激光共聚焦檢測(cè)GBP－TI與細(xì)胞表面GRP78相互作用 為驗(yàn)證GBP－TI能否與腸癌細(xì)胞表面的GRP78蛋白結(jié)合，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)了GBP－TI與DLD1細(xì)胞表面GRP78的定位關(guān)系。細(xì)胞表面GRP78蛋白（綠色）和GBP－TI（紅色）復(fù)染結(jié)果表明，GBP－TI和GRP78在DLD1細(xì)胞有明顯的共定位（黃色），表明GBP－TI能夠與腸癌細(xì)胞表面的GRP78蛋白結(jié)合（圖3）。

GBP－TI對(duì)腸癌細(xì)胞存活的影響 為了確定GBP－TI對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響，用不同濃度的GBP－TI處理人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、DLD1、人正常肝臟細(xì)胞HL7702和人胚腎細(xì)胞HEK293。與GST、GST－TI蛋白相比，GBP－TI能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)腸癌DLD1和SW620細(xì)胞死亡，半數(shù)致死劑量約為5μmol／L。在相同濃度下，GBP－TI對(duì)人正常組織細(xì)胞系HEK293和HL－7702細(xì)胞存活影響不顯著（圖4）。以上結(jié)果表明，GBP－TI能夠特異性靶向抑制腸癌細(xì)胞生長，表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異靶向性。

GBP－TI誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 為了進(jìn)一步確定GBP－TI抑制腫瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制，我們用10μmol／L的 GBP－TI處理腸癌 DLD1、SW620細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。與GST、GST－TI蛋白相比，10μmol／L的 GBP－TI處理后，細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮、變圓，部分細(xì)胞發(fā)生漂浮，處理36 h后細(xì)胞完全死亡（圖5 A）。DAPI細(xì)胞核染色后可見細(xì)胞核發(fā)生濃縮變亮，并出現(xiàn)典型的凋亡小體（圖5B）。以上結(jié)果表明，GBP－TI是通過誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡從而抑制腸癌細(xì)胞存活的。

圖3 免疫化學(xué)染色檢測(cè)GBP－TI與細(xì)胞表面GRP78相互作用（×200）Fig 3 Detection of the interaction bet ween GRP78 and GBP－TI by confocal i mmunofluorescence analysis（×200）

圖4 MTT檢測(cè)GBP－TI對(duì)腸癌細(xì)胞生長的影響Fig 4 The effect of GBP－TI on the growth of DLD1，SW620，HEK－293 and HL－7702 cells

圖5 DAPI染色檢測(cè)GBP－TI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（×400）Fig 5 Detection of GBP－TI－induced apoptosis by DAPI staining（×400）

討 論

腫瘤的分子靶向治療是一種非常有前景的治療方式，尋找合適的分子靶點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的關(guān)鍵。GRP78蛋白是存在于所有細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶蛋白，幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈折疊與裝配，并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控［9］。值得關(guān)注的是，腫瘤細(xì)胞中的GRP78蛋白可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面發(fā)揮信號(hào)分子受體的功能［10］。已發(fā)現(xiàn)多個(gè)多肽序列可以與GRP78蛋白結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化過程，這為以GRP78為分子靶點(diǎn)的腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。本課題組發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞表面也存在GRP78蛋白分子，因此構(gòu)建了GRP78結(jié)合多肽WIFPWIQL與綠豆胰蛋白酶抑制劑賴氨酸活性片段的融合蛋白GBP－TI，實(shí)現(xiàn)了靶向誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡，為腫瘤的靶向治療提供了一種有效、可行的策略。

本課題組前期研究了綠豆胰蛋白酶抑制劑賴氨酸活性片段GST－TI對(duì)大腸癌細(xì)胞生物特性的影響，發(fā)現(xiàn)GST－TI能夠抑制大腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞遷移，但對(duì)細(xì)胞存活無顯著影響［8］。添加了GRP78結(jié)合多肽WIFPWIQL后的GBP－TI蛋白不但保留了GST－TI的胰蛋白酶抑制劑活性，而且表現(xiàn)出對(duì)人腸癌細(xì)胞特異靶向性殺傷，而對(duì)人正常組織細(xì)胞系生長的影響不明顯。我們認(rèn)為，GST－TI分子中的WIFPWIQL可通過與腸癌細(xì)胞表面的GRP78蛋白結(jié)合，來介導(dǎo)GST－TI分子的細(xì)胞內(nèi)化過程。進(jìn)入細(xì)胞中GST－TI則通過干擾細(xì)胞中細(xì)胞器或功能分子的正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞器都具有胰蛋白酶活性，如泛素－蛋白酶體降解系統(tǒng)中的蛋白酶體（proteasome）的20 S催化顆粒具有類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和肽－谷氨酰胺肽水解酶活性，并且其活性狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞正常功能的維持至關(guān)重要。蛋白酶體抑制劑能通過抑制蛋白酶體活性進(jìn)而干擾和影響細(xì)胞原有的功能，尤其是對(duì)腫瘤生長有明顯的抑制作用［11］。因此，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的GBP－TI可能通過抑制蛋白酶體的胰蛋白酶活性干擾細(xì)胞內(nèi)泛素－蛋白酶體降解系統(tǒng)正常功能，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。GBP－TI是否通過細(xì)胞表面GRP78蛋白進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而以泛素－蛋白酶體系統(tǒng)為靶點(diǎn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)（圖6）。此外，GBP－TI靶向抗腫瘤效應(yīng)還需要在體整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 GBP－TI結(jié)合癌細(xì)胞表面GRP78進(jìn)入細(xì)胞抑制蛋白酶體活性引起癌細(xì)胞死亡Fig 6 The pathway of GBP－TI enters into cancer cells and inhibits activity of proteasomes，which further induces apoptosis by the association of GBP－TI and cell surface GRP78

綜上所述，本研究采用基因工程的方法構(gòu)建了基于綠豆胰蛋白酶抑制劑、以細(xì)胞表面GRP78蛋白為靶點(diǎn)的重組靶向抗腫瘤活性分子GBP－TI。GBPTI能夠特異、高效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織細(xì)胞生長影響不明顯，表現(xiàn)出抗腫瘤靶向性。本研究為多肽類腫瘤靶向藥物的開發(fā)提供了一種新的實(shí)現(xiàn)策略，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

致謝 本研究得到了戚正武院士及其課題組的指導(dǎo)和大力支持。

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