食管鱗形細胞癌及轉移性淋巴結組織中CXCL12及其受體CXCR4的表達和臨床意義

盧春來 郭 晶 古 杰 葛 棣 丁建勇 林宗武

（復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032）

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，2008年全世界范圍內食管癌新發病例約為48萬，因食管癌致死的患者約40萬；包括中國在內的發展中國家食管癌發病率明顯高于發達國家，并且這些地區的食管癌病理類型主要為鱗癌［1］。食管癌具有高侵襲性，且易發生轉移，尤其表現為淋巴結轉移。食管癌患者預后較差，雖然近30年來隨著醫療技術水平的發展，食管癌患者5年生存率有所提高，但僅為17%［2］。因此研究食管癌侵襲及轉移機制成為目前迫切需要解決的問題。

CXCR4是一種趨化因子受體，研究表明，CXCR4在多種實體惡性腫瘤中高表達，與患者預后密切相關，同時CXCR4與其單一配體CXCL12結合，可以激活下游多條信號通路，從而導致腫瘤轉移［3］。本研究檢測食管鱗癌患者原發腫瘤及轉移性淋巴結組織中腫瘤細胞CXCR4及CXCL12的表達情況，分析它們和患者臨床病理特征及預后的關系。

資料和方法

研究對象 收集2006年在復旦大學附屬中山醫院胸外科行根治性手術的154例胸段食管鱗形細胞患者的石蠟標本（包括腫瘤及正常組織），同時收集45例患者腫瘤轉移性淋巴結組織標本。病理診斷由兩位病理學專家共同認定，食管癌TNM分期參照AJCC（美國癌癥聯合委員會）標準（第6版）。

病例一般情況 男性，119例，女性，35例；年齡，38～85歲，平均年齡62歲，其中＞60歲78例，≤60歲76例；按腫瘤分化程度分組：Ⅰ級14例，Ⅱ級114例，Ⅲ26例 ；按腫瘤浸潤深度分組：黏膜層及黏膜下層（T1）12例，肌層（T2）41例，全層（T3）95例，侵犯周圍組織（T4）6例；按腫瘤大小分組：＜3 c m 69例，≥3 c m 85例；按區域淋巴結轉移情況分組：N091例，N163例；按TNM分期分組：Ⅰ期10例，Ⅱa期77例，Ⅱb期13例，Ⅲ期54例。

免疫組化染色 切片常規脫蠟至水，以3%的過氧化氫靜置10 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗，經抗原微波修復后分別以CXCL12抗體（Cl one 79018，美國 R＆D 公司，稀釋濃度1∶300）及CXCR4抗體（Clone 44716，美國R＆D 公司，稀釋濃度1∶250）4℃過夜，之后Envision二抗（丹麥DAKO公司）37℃孵育30 min，DAB顯色液，蘇木精復染、封片。以PBS緩沖液代替一抗，其他步驟不變，結果作為陰性對照。

免疫組化結果的評價 所有病理切片由兩位不了解患者病情及研究內容的病理科醫師共同判斷。參考相關文獻報道［4－5］及預實驗結果，根據切片中腫瘤細胞數目染色百分比及染色強弱判斷CXCL12及CXCR4表達水平，給予相應積分：無表達，計0分；染色百分比≤50%，不管染色強弱，均計1分；染色百分比＞50%，染色弱陽性，計2分；染色百分比＞50%，染色強陽性，計3分。0分和1分定義為低表達，2分和3分定義為高表達。

統計學分析 應用Stata 11．0統計軟件。對各指標和患者臨床特征進行相關性分析，兩組間和多組間比較分別采用 Wilcoxon、Kr uskal－Wallis秩和檢驗。CXCL12和CXCR4表達水平相關性采用Spear man秩相關檢驗。原發腫瘤組織與淋巴結轉移性腫瘤組織之間CXCL12和CXCR4表達水平比較采用t檢驗。

按照年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移個數、腫瘤分化、術后化療以及CXCL12、CXCR4高低表達分組，分別對患者無瘤生存期及總生存期進行生存分析（Kaplan－Meier法），兩組或多組生存率采用Log－rank檢驗（單因素分析）。

以年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移、腫瘤分化、術后化療以及CXCL12、CXCR4表達作為協變量，分別對患者無瘤生存期（disease free survival，DFS）及 總 生 存 期 （overall sur vival，OS）進行Cox回歸分析（多因素分析）。

P＜0．05為差異有統計學意義，P＜0．01為差異有顯著性統計學意義。

結 果

CXCL12和CXCR4染色表達情況 CXCL12陽性表達主要定位于腫瘤細胞膜和細胞質（圖1 A、B）；CXCR4陽性表達主要定位于腫瘤細胞核、細胞質以及細胞膜（圖1 C、D），按上述評分標準，CXCL12及CXCR4高表達率分別為53．2%和65．6%。

圖1 CXCL12和CXCR4在食管癌原發腫瘤及腫瘤轉移性淋巴結組織中的表達情況Fig 1 CXCL12 and CXCR4 expressions in the pri mary and metastatic tumors

相關性比較結果

CXCL12和CXCR4表達水平與食管癌臨床病理特征的相關性分析 CXCL12表達水平與患者臨床病理學特征（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及腫瘤細胞分化）無明顯相關性，差異無統計學意義（P＞0．05）。不同性別組的CXCR4表達水平有差異，差異具有統計學意義（P＜0．05）；CXCR4表達水平與腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移、TNM分期關系密切，差異具有顯著統計學意義（P＜0．01，表1）。

表1 CXCR4和CXCL12表達水平與食管癌臨床病理特征的相關性分析Tab 1 Analysis of the associations bet ween CXCL12／CXCR4 expressions and clinicopathologic features （n）

原發腫瘤組織中CXCL12和CXCR4表達的相關性分析 原發腫瘤組織中CXCL12和CXCR4表達水平具有相關性（P＝0．014，r＝0．198）。

原發腫瘤組織和腫瘤轉移性淋巴結組織中CXCL12和CXCR4表達水平的比較 45例腫瘤轉移性淋巴結組織中，CXCR4表達評分均值明顯高于與其配對的原發腫瘤組織（2．03 vs．1．84），差異有顯著統計學意義（P＜0．01）；而CXCL12表達評分均值雖高于原發腫瘤組織（2．82 vs．1．93），但差異無統計學意義（P＞0．05，圖2）。

圖2 原發及轉移性腫瘤組織中CXCL12和CXCR4免疫組化評分的比較Fig 2 The comparison of CXCL12 and CXCR4 scores bet ween pri mary and metastatic tumors

單因素分析 單因素分析（表2）發現，CXCL12高表達患者DFS及OS低于CXCL12低表達患者，但差異無統計學意義（P＞0．05）；CXCR4高表達患者DFS及OS明顯低于CXCR4低表達患者，差異有顯著統計學意義（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4聯合表達陽性的患者，其DFS及OS明顯低于CXCL12和CXCR4聯合表達陰性的患者，差異有顯著統計學意義（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4聯合表達陽性的患者，其中位DFS低于CXCR4陽性表達的患者（20個月vs．22個月）；年齡、性別、腫瘤浸潤深度、分化程度及TNM分期也與患者生存預后相關（P＜0．05）；而腫瘤大小及術后化療則與患者生存預后無明顯相關性（P＞0．05）。另外，區域性淋巴結轉移陽性患者DFS及OS明顯低于陰性患者，差異有顯著統計學意義（P＜0．01，圖3）。

多因素分析 Cox回歸分析（表3）顯示，CXCR4高表達及區域性淋巴結轉移是患者DFS和OS的獨立預后不良因素（P＜0．05）。而年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化，CXCL12高表達和術后化療并不是患者DFS及OS的獨立預后不良因素（P＞0．05）。

表2 食管癌患者預后的單因素分析Tab 2 Univariate analysis of patients′survival （n）

圖3 CXCL12和CXCR4表達水平與患者預后的關系Fig 3 The associations bet ween CXCL12 and CXCR4 expressions and patients′prognosis

表3 食管癌患者預后的多因素分析Tab 3 Multivariate analysis of patients′survival

討 論

趨化因子系統指的是一些小分子前炎性因子及其受體，它們參與調節感染、炎癥以及組織修復相關的免疫反應，并且可以在胚胎形成階段調控多種細胞的遷移。趨化因子受體CXCR4是由352個氨基酸構成的視紫紅質樣G蛋白偶聯受體。基質衍生因 子 （str o ma－derived f actor 1，SDF－1），亦 稱CXCL12，是由68個氨基酸構成的小分子細胞因子，屬于CXC趨化因子家族，目前認為CXCL12是CXCR4的唯一配體。CXCR4是腫瘤中表達最為普遍的細胞因子受體，其配體CXCL12則在肺、肝臟、骨髓及淋巴結等腫瘤易于轉移的器官中有高表達，由此促成了腫瘤的靶向轉移。目前，已在胰腺癌、肺癌、乳腺癌和結腸癌等研究中證實CXCL12／CXCR4信號軸在惡性腫瘤轉移擴散中起關鍵作用［6］。

關于CXCL12／CXCR4與食管癌侵襲和轉移之間的關系，目前相關研究結果并不一致。日本學者的研究［7］表明，CXCL12和CXCR4在食管鱗形細胞癌組織中均為高表達，CXCL12與食管癌患者淋巴結轉移、TNM分期具有相關性，且與患者預后密切相關，CXCL12高表達的患者生存時間明顯低于CXCL12低表達患者（P＜0．01）；而CXCR4與患者臨床病理特征及預后并無相關性（P＞0．01）。然而，另一項中國學者的研究結果表明［8］，CXCR4與患者臨床病理特征及預后具有相關性（P＜0．01），盡管CXCL12高表達的患者5年生存率低于CXCL12低表達患者，但其差異無統計學意義（P＞0．05）。本次研究，我們也得到了與中國學者相似的結果，進一步驗證了CXCL12和CXCR4在食管鱗癌組織中高表達，且與患者預后有一定的相關性。

為了更加深入的探討CXCL12和CXCR4在食管癌轉移中的作用，我們不僅檢測了原發食管癌組織中CXCL12和CXCR4的表達情況，而且還檢測了這兩個指標在轉移性淋巴結中的表達情況。結果發現，CXCL12在轉移性淋巴結組織中表達強度略高于原發腫瘤組織（P＞0．05）；而轉移性淋巴結組織中CXCR4免疫組化評分明顯高于原發腫瘤組織，但差異無統計學意義（P＜0．01）。和配對的原發腫瘤組織相比較，轉移性淋巴結組織中CXCR4幾乎均為強陽性表達，這一現象也可以說明CXCR4陽性表達的食管鱗癌細胞易于轉移，CXCR4在食管癌轉移過程中起到非常重要的作用。

本次研究，我們還發現原發腫瘤組織中CXCL12和CXCR4均為高表達，兩者表達水平具有顯著相關性（P＜0．01），而且CXCL12和CXCR4共同高表達的患者其中位生存期明顯低于于CXCL12和CXCR4共同低表達的患者（P＜0．01）。在之前的研究中，我們發現食管癌腫瘤組織中CXCR4與基質金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達具有相關性［9］。因此，我們推測食管鱗癌細胞可能通過自分泌CXCL12和CXCR4，兩者結合，激活下游相關信號通路，上調侵襲及轉移相關蛋白（例如MMP－9、VEGF）的表達，從而促進食管癌的侵襲和轉移。在一項關于卵巢癌的研究中，上述的推測已經得到了驗證，研究者在體外抑制卵巢癌細胞株中CXCL12及CXCR4的表達，可以顯著下調轉移相關蛋白，例如MMP－9、u PA的表達水平［10］。

我們的研究僅僅是發現了CXCL12和CXCR4與食管癌轉移有一定的相關性，推測CXCL12／CXCR4信號軸在食管癌轉移中可能起到重要作用。但是，CXCL12／CXCR4信號軸在食管癌中所激活的具體下游信號通路及關鍵節點分子的深入探討則需要進一步的體外體內實驗研究。

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