氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉模型在炎癥性腸病和癌形成物質的生物測定運用

林凱璇，趙曉航

惡性腫瘤是威脅人類生命健康的主要原因，每年因此死亡人數達760萬[1]。由于機體、疾病和社會之間錯綜的復雜性，科研工作者在攻克疾病過程中困難重重。例如，慢性炎癥發展為癌癥是一個多基因參與、多步驟完成的復雜過程。在倫理道德允許條件下，獲取人體組織樣本尤其是癌前病變組織樣本非常困難。因此，借助動物模型成為科學研究的重要手段。本文針對炎癥性腸病(inflammatory disease，IBD)致直結腸癌(colorectal cancer，CRC)動物模型——氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)模型及其在生物測定運用作一綜述。

1 炎癥性腸病和癌形成

CRC是全球常見致死性惡性腫瘤之一，發病率分居男性第二、女性第三[1]。CRC是IBD最嚴重的并發癥。所謂IBD是一類病因和發病機制尚未完全明確的腸道炎性疾病，它是遺傳和環境因素相互作用的綜合結果，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)兩種病理類型。IBD臨床表現為不斷復發、緩解的復雜病程，病理表現為周期性腸黏膜壞死和再生。這個重復損傷與修復的過程增加了黏膜上皮惡變的風險，促進癌形成的作用，對患者身體機能、生活質量和醫療負擔都有明顯的消極影響[2]。雖然IBD相關癌變僅占全部CRC的1%～2%[3]，但流行病學顯示IBD呈逐年上升和年輕化趨勢[4]，發病8～10后以每年0.5%～1%風險率遞增，30年后風險率可達18%。因此，通過防治IBD預防CRC形成是減少CRC發病率的有效手段之一。

2 AOM/DSS模型和特性

AOM/DSS模型是目前使用最廣泛的CRC化學誘導模型[1]，它在致癌劑AOM誘發突變損傷基礎上，使實驗鼠持續暴露在致炎劑DSS環境下發展而來[5]。因此，AOM/DSS模型實際上展示的是一種IBD導致CRC的過程。

AOM 是致癌劑 1，2-二甲基肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)中間代謝產物，其引起的鳥嘌呤O6甲基化是誘導突變損傷最重要原因。由AOM引起的癌形成與人類CRC組織病理學類似，但這種建模方式需要多次AOM注射且周期長，給科研工作帶來諸多不便[6]。致炎劑DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，它的負電荷能影響DNA合成，抑制上皮細胞增生和破壞腸黏膜屏障，導致巨噬細胞功能障礙和腸道菌群失調。利用DSS飼喂制備的炎癥性腸病模型具有類似人類UC的病理改變和臨床癥狀。多循環DSS處理也能誘導實驗動物產生CRC，但制備時間長且腫瘤發生率和數量低[7]。由于炎癥致癌是一個多步驟、多基因的復雜過程，持續的炎癥刺激是癌癥產生的關鍵[8-9]。1996 年，Okayasu 等[2]聯合AOM(7.5 mg/kg)和3%DSS處理CBA/J小鼠成功構建了成瘤率和重復性高的CRC模型，不僅大大縮短了制備周期，而且為科研工作提供新的思路[5]。此后研究表明，AOM或DSS劑量和實驗鼠品系是影響模型誘導的關鍵因素[10-11]。如致炎劑DSS的促癌作用具有劑量依賴性，只有DSS濃度大于1%才能促進腫瘤形成，但高劑量DSS水可引起小鼠發生嚴重的腸道炎癥和硝基化應激反應[12]。BALB/c和C57BL/6N小鼠對AOM/DSS誘導敏感性高;C3H/HeN和DBA/2N小鼠則對AOM/DSS不敏感，處理后不發生或很少發生腺瘤[13]。因此，通過選用小鼠品系或調整AOM、DSS劑量來優化模型，以進一步提高腫瘤生成率[14-15]。

AOM/DSS模型制備分為“四步法”和“兩步法”兩種:“四步法”為單劑量AOM(7.5～12.5 mg/kg)腹腔注射后，即時或7 d后開始3個循環1%～3%DSS水飼喂實驗鼠，每個循環4～7 d，間隔14 d;“兩步法”則是單劑量AOM加單次DSS周期處理，共兩步完成。與“兩步法”相比，“四步法”加速了腫瘤的生長[6]。

癌前病變是正常組織向癌癥發展的中間狀態。IBD患者結直腸黏膜的單一不典型增生是癌前病變的表現，由IBD引起的CRC組織病理學由“正常→低度不典型增生→高度不典型增生→腺癌”順序演變而來[7，15]。Suzuki等[15]采用 AOM(10 mg/kg)腹腔注射和單循環2%DSS飲水飼喂雄性ICR小鼠，觀察炎癥致癌形成不同時期病理學改變，證明經AOM/DSS處理的小鼠完全模擬了炎癥相關CRC形成的組織病理學過程。除此之外，AOM/DSS模型常伴K-ras、β-catenin基因突變，有的還由錯配修復基因系統缺失顯示微衛星不穩定，在一定程度上也模擬了人類CRC基因水平上的變化[5]。

3 AOM/DSS模型在IBD和癌形成物質的生物測定運用

由于AOM/DS模型能夠高效、可重復地模擬人類IBD相關CRC特性，越來越多的科研人員利用它來進行IBD致癌的機制研究、藥物毒性或治療效果評估等。之前綜述了AOM/DSS模型在炎癥相關癌變機制的研究[16]，在此主要總結部分運用 AOM/DSS模型探索防治或促進腸炎致結腸癌相關物質的生物測定研究(表1)。生物測定(bioassay)是利用生物來檢測物質作用的方法[17]。IBD導致CRC過程中，人們無法得知毒物或藥物對整個疾病發展過程是否產生影響或產生何種影響以及其中的作用機制是什么，因此科研人員借助AOM/DSS模型這一平臺，可能能夠回答上述問題。

IBD的病理機制與炎癥介質升高有關，包括活性氧族(reactive oxygen species，ROS)、誘導型一氧化氮合酶(inducible oxide synthase，iNOS)、前列腺素類(prostaglandins，PGs)和細胞因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor nerosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)]等[21]。轉錄因子如核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和轉錄激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT-3)異常激活導致細胞存活、不受限制增生[31-32]。研究表明，IBD通過NF-κB信號通路導致CRC發生，啟動NF-κB－IL-6－STAT-3級聯反應促進腫瘤細胞增生[33-34]。對比表中不難發現，多數天然有機物、維生素類和非甾體抗炎藥類防治炎癥致癌的物質，主要通過減少炎癥介質[如IL-6、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、NO、前列腺素 E(prostaglandin E，PGE)等]釋放，降低 β-連環蛋白，減少氧化應激反應，誘導細胞凋亡啟動子半胱天冬酶(Caspase)等機制來抑制AOM/DSS模型炎癥刺激和CRC形成。

山藥主要成分薯蕷皂苷配基具有抗高血糖、高膽固醇、高三酰甘油和抗癌作用，其既不能在哺乳動物中合成也不能被代謝為類固醇，對人體安全。Miyoshi等[18]實驗表明，山藥粉/薯蕷皂苷配基能夠通過降低炎性因子和增加脂蛋白酯酶從而降低三酰甘油類表達和改善脂類代謝;增加血紅素加氧酶、過氧化物歧化酶-3、Casepase-6的表達增強抗氧化應激反應能力和誘導凋亡。葡萄內酯主要存在蕓香和傘形科植物中，屬于次級代謝物，能抗炎，減少iNOS、COX-2、氮負離子和PGE2等產生，還可以抑制TNF-α釋放和抑制性蛋白κB降解。葡萄內酯能抑制AOM/DSS引起的結腸炎相關性結腸癌形成，且沒有任何副作用[19]。川陳皮素通過使促分裂原活化蛋白/細胞外信號調節蛋白激酶的失活來降低瘦素分泌，從而降低AOM/DSS腺瘤和腺癌的發生[20]。苯乙基異硫氰酸鹽(phenethyl-isothiocyanate，PEITC)是十字花科蔬菜中葡糖異硫氰酸鹽的代謝物，能夠誘導腫瘤細胞周期障礙和凋亡;二苯甲酰甲烷(dibenzoylmethane，DBM)是姜黃素 β-二酮基結構，甘草中含少量該成分，具有抗腫瘤形成特性。Cheung等[22]發現 PEITC 主要通過增加 Caspase-3、Caspase-7和p21來增加凋亡和抑制細胞周期;而DBM主要通過誘導核因子E2相關因子2和Ⅱ期去毒酶產生來防止致癌劑AOM毒性作用。5-氨基水揚酸是柳氮磺吡啶活化部分，具有抗炎、抗增殖和促凋亡作用。雖然5-氨基水揚酸能減低直結腸炎引起CRC，但化學預防作用與COX-2蛋白表達無關[30]。

流行病學顯示，長期規律服用阿司匹林可以降低CRC的發生[35]。AOM/DSS模型實驗證明，添加阿司匹林并不能有效減少結腸腫瘤數目和炎癥程度，但是阿司匹林能影響IL-6－STAT-3通路促進腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無影響。提示阿司匹林的靶點可能是CRC細胞，適合聯合其他藥物加強治療效果[26]。葉酸缺乏與散發和炎癥性結腸癌有關，但AOM/DSS模型生物測定證明增加葉酸攝入對IBD及其相關CRC并沒有影響。雖然高同型半胱氨酸血癥與小鼠結腸腫瘤發生呈負相關，葉酸缺乏引起高同型半胱氨酸;但實驗提示，模型小鼠葉酸缺乏是由于結腸炎導致吸收不良引起，而非引起腫瘤的原因[26]。

職業或環境中可能接觸致癌性金屬，水源污染是人們暴露于這些金屬的常見途徑。三價砷和六價鉻屬于Ⅰ類致癌劑。給AOM/DSS小鼠飼喂含砷或鉻的水，發現這些金屬元素致癌機制主要通過增加β-連環蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1和促進DNA氧化損傷，同時降低抗氧化酶的表達[28]。

表1 AOM/DSS模型生物測定實驗

生物測定利用生物如動植物、細胞和微生物等模型來檢測某物質的作用，這種方法常被用于發展新藥和檢測毒性。AOM/DSS模型是目前公認的CRC化學誘導模型，由于能夠很好地模擬IBD引起的CRC組織病理學全過程，成為潛在治療藥物的療效和毒性等生物測定的常用平臺。通過綜合比較不難發現，對防治CRC有效的保護性藥物大多具有抗炎、抗氧化、抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的功效，機制與炎性因子、炎癥相關信號通路息息相關。致癌性物質則通過促進DNA損傷、增加氧化誘導癌發生。除生物測定外，利用AOM/DSS模型進行的研究還涉及炎癥致癌信號通路、腫瘤微環境等。由于該模型小鼠壽命短，且少有結腸腺瘤性息肉病基因和p53基因突變，CRC發生遠處轉移傾向低，因此不適合研究腫瘤侵襲相關研究[5]。隨著AOM/DSS模型和基因突變等方法結合，使該模型發展不斷完善，為進一步探討和解決科學問題提供更好平臺。

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