大孔吸附樹脂分離純化Pneumocandin B0的研究

謝新宇，孔 鵬，冷 鳳，張 煒

（微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊050015）

卡泊芬凈（Caspofungin）是一種廣譜抗真菌藥物，由美國Merck公司開發，2001年上市[1］。卡泊芬凈的作用機制是非競爭性地抑制真菌細胞壁的β－（1，3）－D－葡聚糖的合成，從而破壞細胞壁的完整性，最終導致真菌細胞溶解、死亡[2］。該藥物對于臨床常見的念珠菌屬和曲霉菌屬均有良好的抗菌效果，同時由于其特殊的作用機制，該類藥物還具有較高的安全性[3］。

天然產物Pneumocandin B0（PB0）經側鏈修飾后得到的環狀六肽母核是合成卡泊芬凈的主要原料，PB0分子式為C50H80N8O17，分子量1065.21，結構式見圖1[4］。目前關于PB0分離純化的報道較少，提取工藝較為復雜。作者采用大孔樹脂吸附法提取分離發酵液中的PB0，效果較好。

圖1 Pneumocandin B0結構式Fig.1 The structural formula of Pneumocandin B0

1 實驗

1.1 試劑與儀器

PB0發酵液，華北制藥新藥研發中心；PB0標準品，自制。

大孔吸附樹脂 XAD－4、XAD－1600，羅門哈斯公司；LX－18、LX－20，西安藍曉科技有限公司；HZ801、HZ818、HZ820、HZ841，上海華震科技有限公司；乙腈（色譜純），美國Merck公司；乙醇（工業級），滄州興隆化工有限公司；去離子水，自制；其它試劑均為國產分析純。

高效液相色譜儀，Shimadzu公司；攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樹脂的預處理與再生

預處理方法：樹脂用乙醇充分浸泡24h以上，期間間歇攪拌（除去樹脂表面制孔劑、色素、雜質等），之后用大量去離子水洗至洗滌液加水不再產生白色渾濁為止；再用4BV 1mol·L－1NaOH 溶液攪拌浸泡4h（除去酸性物質），用去離子水洗至中性；再用4BV 1mol·L－1HCl溶液攪拌浸泡4h（除去堿性物質），用去離子水洗至中性。

再生方法與預處理方法基本相同。

1.2.2 發酵液預處理

PB0發酵液經真空抽濾后用去離子水洗滌，得到菌絲體；菌絲體用2BV乙醇攪拌浸泡3h，真空抽濾，得到PB0浸提液；浸提液加去離子水調至乙醇體積分數為30%，HPLC檢測其純度為13.3%。

1.2.3 樹脂靜態吸附量與解吸收率的測定

稱取8種預處理完畢的大孔吸附樹脂各2g（為濾干后濕重，下同），置于250mL錐形瓶中，分別加入PB0浸提液150mL，常溫低速攪拌3h，過濾，檢測濾液中PB0的質量濃度；取過濾后樹脂加入150mL乙醇，在相同條件下進行解吸，檢測解吸液中PB0的質量濃度。根據式（1）、（2）計算樹脂對PB0的靜態吸附量和解吸收率：

式中：Q為樹脂靜態吸附量，μg·g－1；ρ0為原液質量濃度，μg·mL－1；ρ1為吸附殘液質量濃度，μg·mL－1；V1為加樣體積，mL；m 為樹脂質量，g；D 為解吸收率，%；ρ2為解吸液質量濃度，μg·mL－1；V2為解吸液體積，mL。

1.2.4 樹脂靜態洗脫實驗

稱取預處理好的5份HZ818樹脂各2g，置于250mL錐形瓶中，加入過量PB0浸提液吸附至飽和，過濾。取濾干樹脂分別加入150mL 30%、40%、50%、60%、70%乙醇，常溫低速攪拌3h，過濾，檢測洗脫液中PB0的質量濃度，根據式（2）計算不同體積分數乙醇對HZ818樹脂的解吸收率。

1.2.5 樹脂動態解吸實驗

取預處理好的3份HZ818樹脂各200mL，濕法裝入3根玻璃柱（Φ∶H＝1∶7）。取同一批號的PB0浸提液上樣，上樣流速為200mL·h－1（即1BV·h－1），HPLC檢測流出液濃度，當柱出口PB0濃度接近上樣液濃度10%時停止上樣，取600mL40%乙醇按相同流速洗柱。3根樹脂柱分別用75%、85%、95%乙醇解吸，解吸流速控制為100mL·h－1（即0.5BV·h－1），解吸液每50mL（即0.25BV）收集為一瓶，HPLC監測解吸液PB0含量。合并收集PB0濃度大于100μg·mL－1的解吸液，用HPLC峰面積歸一化法測定純度。

1.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈－水 （50∶50，體積比）；流速1.0mL·min－1；柱溫40℃；檢測波長210nm；進樣量10μL。

2 結果與討論

2.1 樹脂的選擇

8種大孔吸附樹脂的靜態吸附量和解吸收率見表1 。

表1 8種大孔吸附樹脂的靜態吸附量和解吸收率Tab.1 Static adsorption amount and desorption yield of eight kinds of macroporous adsorptive resins

由表1 可以看出，HZ818樹脂對PB0的靜態吸附量和解吸收率最高，分別達10 436μg·g－1和95.3%，表明其可以很好地分離PB0。故選取HZ818樹脂作為吸附樹脂進行后續實驗。

2.2 洗脫條件的選擇

洗脫劑是影響大孔吸附樹脂吸附分離的重要因素，不同洗脫劑對于大孔吸附樹脂有不同的溶脹度，洗脫液中各溶質的組成也有所不同。以不同體積分數乙醇進行HZ818樹脂的洗脫，解吸收率見圖2。

圖2 不同體積分數乙醇的解吸收率曲線Fig.2 Yield of static desorption with different volume fractions of ethanol

由圖2可以看出，70%乙醇對PB0有較好的洗脫效果，故可選用70%以上乙醇作為解吸劑；50%乙醇洗脫會造成PB0較多的損失，影響解吸收率；40%乙醇的PB0解吸收率僅有2.3%且洗脫液呈淺黃色，HPLC檢測其中含有較多雜質，是比較理想的雜質洗脫劑。故樹脂吸附飽和后先用40%乙醇洗脫部分色素和極性較大的雜質，再用較高體積分數乙醇解吸。進行動態解吸實驗，不同體積分數乙醇的解吸效果比較見表2 。

2.3 解吸條件的確定

表2 不同體積分數乙醇解吸效果比較Tab.2 The comparison of desorption efficiencies of ethanol with different volume fractions

由表2 可以看出，75%乙醇解吸不完全，拖尾較嚴重，不適合作為解吸劑；85%、95%乙醇解吸基本不拖尾，而95%乙醇解吸收率比85%乙醇雖略有提高，但其解吸液色譜純度較85%乙醇解吸液明顯下降，溶液色度也較深，這說明當乙醇體積分數過高時，大量的雜質一同被解吸下來。綜合考慮，宜選取85%乙醇作為解吸劑。

3 結論

研究了用大孔吸附樹脂從發酵液中提取Pneumocandin B0的工藝條件。從8種大孔吸附樹脂中篩選出的大孔吸附樹脂HZ818可以很好地分離PB0，靜態吸附量達10 436μg·g－1。用 HZ818樹脂柱吸附飽和后，先用40%乙醇洗滌、再用85%乙醇解吸，解吸收率達到91.6%，PB0濃度富集20倍以上，色譜純度由13.3%提高至78.6%，為后續的精制工藝奠定了基礎。該吸附－洗滌－解吸工藝簡單易行、成本低、環保，適合工業化生產。

[1]李岷，沈永年，呂桂霞，等.棘白菌素類抗真菌藥[J］.中國真菌學雜志，2009，4（4）：249－256.

[2]Denning D W.Echinocandin antifungal drugs[J］.Lancet，2003，362（9390）：1142－1151.

[3]Deresinski S C，Stevens D A.Caspofungin[J］.Clin Infect Dis，2003，36（11）：1445－1457.

[4]滕云，陳正杰，鄭玲輝，等.棘白菌素類抗真菌藥物的結構與微生物合成[J］.中國醫藥工業雜志，2010，41（10）：776－782.