化學(xué)－酶催化法制備D－谷氨酸與γ－氨基丁酸

楊成麗，馬子玉，胡曉麗，李大力

（1.南京理工大學(xué)生物工程系，江蘇 南京210094；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)系，江蘇 南京210014；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京210014）

L－谷氨酸脫羧酶（L－Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一種廣譜酶，可以催化L－谷氨酸（L－Glu）脫羧生成 γ－氨 基 丁 酸 （γ－Aminobutyric acid，GABA）[1］。GABA是有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛，近年來(lái)在食品行業(yè)也越來(lái)越受關(guān)注[2，3］。GABA目前主要采用化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，化學(xué)合成法安全性較差，植物富集的GABA含量很低，微生物發(fā)酵法主要使用含有GAD的菌種來(lái)發(fā)酵生產(chǎn) GABA[3－5］。

D－谷氨酸（D－Glu）是許多藥物、生物活性物質(zhì)以及聚合體的重要前體和中間體，可與多種金屬形成配合物，在超分子化學(xué)中也得到了廣泛應(yīng)用[6］。目前，DGlu的制備方法主要有手性拆分法、生物轉(zhuǎn)化法兩種，手性拆分法是利用手性拆分劑分離DL－Glu來(lái)生產(chǎn)DGlu[7］，該法工藝復(fù)雜，工業(yè)化應(yīng)用難度較大。生物轉(zhuǎn)化法是利用菌體或酶來(lái)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D－Glu。

作者從保加利亞乳桿菌粗提得到GAD，采用酶催化法由DL－Glu制備得到了D－Glu和GABA。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii sp.Bulgaricus）從市售伊利原味酸奶中分離得到。接種環(huán)挑取市售伊利原味酸奶，平板劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行顯微鏡鏡檢，確定目的菌落。

改良LB培養(yǎng)基：蛋白胨2g·L－1，酵母膏5g·L－1，L－Glu 25g·L－1，pH 值6.0。

1.2 試劑與儀器

所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

WXG－4型旋光儀，上海光學(xué)儀器廠。

1.3 L－谷氨酸的消旋

參照文獻(xiàn)[8］方法對(duì)L－Glu進(jìn)行消旋。在1L圓底燒瓶中加入54.08g（0.32mmol）L－Glu、400mL乙酸和20mL蒸餾水，水浴加熱并攪拌，L－Glu全部溶解后，加入4mL水楊醛于90℃攪拌反應(yīng)7h，加入6g活性炭，煮沸5min，過(guò)濾，旋蒸濃縮后用1mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.2，過(guò)濾收集沉淀，用少量蒸餾水洗滌，干燥，即為DL－Glu。

1.4 L－谷氨酸脫羧酶粗提物的制備

將菌種接種于5mL改良LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，用蒸餾水重懸，冰浴中超聲破碎菌體，加2BV冷凍丙酮，混勻后于－20℃放置10min，離心收集沉淀，即得GAD粗提物。

1.5 D－Glu與GABA的制備

將由5mL菌液制備得到的GAD粗提物、2mL 4 mmol·L－1的磷酸吡哆醛溶液、8mL 50mmol·L－1的DL－Glu（用pH 值4.4的 H3PO4－NaH2PO4緩沖溶液配制）混合均勻，于37℃反應(yīng)不同時(shí)間。

反應(yīng)液旋蒸濃縮后用1mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.2，靜置后抽濾，獲得D－Glu，測(cè)定旋光度，參照文獻(xiàn)[9］計(jì)算D－Glu的光學(xué)純度。濾液參照文獻(xiàn)[10］加入2BV乙醇后，調(diào)節(jié)pH值至7.3，待有沉淀析出后抽濾，獲得GABA，計(jì)算收率。

1.6 產(chǎn)物分析方法

采用薄層層析（TLC）分析反應(yīng)體系中產(chǎn)物的形成，取一定時(shí)間的反應(yīng)液在經(jīng)過(guò)活化的硅膠板（G254）點(diǎn)樣層析，展層劑為正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶3（體積比）。采用旋光儀測(cè)定谷氨酸的旋光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DL－Glu的制備

實(shí)驗(yàn)得到 DL－Glu 38.86g，消旋率為94.92%，收率為71.9%。

2.2 D－Glu與GABA的制備

GAD能專一性催化L－Glu的脫羧反應(yīng)，卻不能催化D－Glu脫去羧基，因此，GAD可將DL－Glu中的LGlu轉(zhuǎn)化為GABA。通過(guò)薄層層析（TLC）對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)不同時(shí)間，DL－Glu底物反應(yīng)液的TLC分析結(jié)果Fig.1 The TLC results for DL－Glu substrate solution reacted for different times

由圖1可知，反應(yīng)50h時(shí)，反應(yīng)液點(diǎn)樣層析后得到兩個(gè)大小基本一致的點(diǎn)，表明酶催化反應(yīng)基本完成。D－Glu收率為81%，光學(xué)純度為93.2%。GABA收率為48.7%。產(chǎn)物D－Glu與GABA的TLC分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論

圖2 產(chǎn)物TLC分析結(jié)果Fig.2 The TLC results for the product

采用化學(xué)－酶法制備了D－Glu和GABA。將LGlu通過(guò)化學(xué)消旋制備DL－Glu，再用GAD將DL－Glu中的L－Glu轉(zhuǎn)化為GABA。用等電點(diǎn)沉淀法獲取DGlu和GABA，所得D－Glu的光學(xué)純度為93.2%、收率為81%，GABA收率為48.7%。

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