流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣在井岡霉素生物發(fā)酵中的研究

劉義雄，張文宣，周圣驕，谷 田，鐘名興

（江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干331307）

井岡霉素是我國(guó)農(nóng)用抗生素中產(chǎn)量和用量最大的品種，多用于防治水稻紋枯病、稻曲病和蔬菜苗期立枯病、白絹病等，是一種無(wú)公害無(wú)殘留的環(huán)保型農(nóng)藥[1－4］。

井岡霉素是吸水鏈霉菌井岡變種發(fā)酵過(guò)程中的代謝物，有A、B、C、D、E、F 6個(gè)組分，其中組分A的藥效最好[5］。井岡霉素的工業(yè)生產(chǎn)采用深層、通氣攪拌二級(jí)或三級(jí)發(fā)酵法，目前其發(fā)酵培養(yǎng)基配方中加有碳酸鈣，用于調(diào)控pH值以保證菌體正常生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)素分泌[6］。井岡霉素產(chǎn)品主要分為水劑和粉劑兩種，水劑的生產(chǎn)工藝為發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理、過(guò)濾、薄膜濃縮、蒸發(fā)等而得，粉劑的生產(chǎn)工藝大多也僅僅是將水劑再進(jìn)行濃縮，然后真空烘干[7］。薄膜濃縮過(guò)程不僅能耗高，而且長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理對(duì)產(chǎn)品有效組分破壞大，使得收率偏低，且產(chǎn)品中雜質(zhì)較多后加工困難。尤其是發(fā)酵培養(yǎng)基中加入碳酸鈣后，料液中含有較多的鈣離子，導(dǎo)致提煉過(guò)程中鈣鹽結(jié)垢容易堵塞薄膜濃縮器列管，需要經(jīng)常清洗列管，使得列管使用壽命縮短、工作效率降低、提煉成本增加，同時(shí)在采用低能耗的膜分離濃縮提取工藝時(shí)，也易導(dǎo)致膜孔堵塞，限制了低能耗膜分離濃縮工藝的應(yīng)用。

已有研究采用流加補(bǔ)氨水的方法來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH值用于赤霉素GA4＋7生物發(fā)酵及后提取，膜分離濃縮效果較好[8］，也有文獻(xiàn)報(bào)道其它品種的通氨工藝研究[9，10］，但均未涉及到流加補(bǔ)氨工藝對(duì)后續(xù)提取工藝、產(chǎn)品質(zhì)量的影響。井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)周期較短，此前未見(jiàn)其中間補(bǔ)氨工藝的相關(guān)報(bào)道。

作者利用5m3中試罐進(jìn)行了井岡霉素發(fā)酵多批次流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣調(diào)控pH值的試驗(yàn)，并在20 m3的生產(chǎn)罐上進(jìn)行了穿插對(duì)比試驗(yàn)，以確定流加補(bǔ)氨水的工藝條件及其對(duì)井岡霉素發(fā)酵、后提取生產(chǎn)水平和產(chǎn)品質(zhì)量的影響，擬為降低生產(chǎn)成本、推廣應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

吸水鏈霉菌井岡變種（Streptomyces hygroscopicus var.jingganus）NRF－0601，江西新瑞豐生化有限公司。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：玉米淀粉36，大米粉10，花生粉25，酵母粉5，磷酸二氫鉀0.1，氯化鈉2.0，泡敵0.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：大米粉100，黃豆粉20，酵母粉10，磷酸二氫鉀1.0，氯化鈉1.6，碳酸鈣3.0，泡敵0.2；中途流加工業(yè)濃氨水（濃度＞25%，用量按流加pH值控制）。

1.2 設(shè)備

700L不銹鋼種子罐；4m3不銹鋼種子罐；5m3不銹鋼發(fā)酵罐；20m3發(fā)酵罐。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)工藝流程

（1）斜面孢子→種子培養(yǎng)液 （350L／700L罐）→發(fā)酵液（4m3／5m3罐）→提煉。

（2）斜面孢子→種子培養(yǎng)液（2.8m3／4m3罐）→發(fā)酵液（18m3／20m3罐）→提煉。

1.3.2 氨水的中途流加

發(fā)酵液pH值降至6.2時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)氨水，全程控制pH值6.0～6.4。

1.3.3 檢測(cè)方法

（1）pH 值采用465－50－SC－P－S7／150／9848型pH測(cè)定儀（梅特勒·托利多）在線檢測(cè)。

（2）氨基氮濃度測(cè)定采用甲醛法。

（3）總糖含量測(cè)定采用裴林試劑法。

（4）固含量測(cè)定采用離心沉淀法。試樣于3000r·min－1離心沉淀10min。固含量按下式計(jì)算：

（5）井岡霉素A效價(jià)測(cè)定采用HPLC法。

檢測(cè)條件：色譜柱為200mm×4.6mm（id）不銹鋼柱，內(nèi)裝ODS－C18填充物，5μm；流動(dòng)相為甲醇－磷酸氫二鈉水溶液（30∶1000），流速1.0mL·min－1；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；進(jìn)樣體積20μL。

流動(dòng)相配制：稱(chēng)取0.71g無(wú)水磷酸氫二鈉溶于1000mL二次重蒸水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，加入30mL甲醇，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾并脫氣，備用。

試樣中井岡霉素A的含量（Xs）按下式計(jì)算：

式中：As為試樣峰面積；Xc為標(biāo)樣含量；c為標(biāo)樣濃度；n為試樣稀釋倍數(shù)；Ac為標(biāo)樣峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 5m3罐發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 工藝參數(shù)分析

在5m3發(fā)酵罐中，進(jìn)行了流加補(bǔ)氨水調(diào)pH值（試驗(yàn)罐）與加碳酸鈣調(diào)pH值（對(duì)照罐）的發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，共進(jìn)行4次試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，繪制代謝曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中的pH值（a）、氨基氮濃度（b）、總糖含量（c）、固含量（d）變化曲線Fig.1 Change curves of pH value（a），amino nitrogen concentration（b），total sugar content（c），solid content（d）in fermentation process

從圖1可知，流加補(bǔ)氨水試驗(yàn)罐的pH值曲線比對(duì)照罐更平穩(wěn)，試驗(yàn)罐pH值均控制在6.1～6.4的受控范圍內(nèi)，而對(duì)照罐pH值控制曲線波動(dòng)明顯較大；與對(duì)照罐相比，試驗(yàn)罐氨基氮濃度較高，但總糖含量和固含量的波動(dòng)很接近，說(shuō)明流加補(bǔ)氨水能保證碳源的正常利用與菌體的正常生長(zhǎng)，對(duì)井岡霉素菌體生長(zhǎng)無(wú)明顯不良影響。

2.1.2 井岡霉素A發(fā)酵效價(jià)

5m3試驗(yàn)罐與對(duì)照罐的井岡毒素A發(fā)酵效價(jià)比 較見(jiàn)表1 。

表1 5m3罐流加補(bǔ)氨水與對(duì)照的井岡霉素A發(fā)酵效價(jià)比較／μg·mL－1Tab.1 Comparison of Jinggangmycin fermentation titers for fed－batch ammonium feeding and the contrast in 5m3 tank／μg·mL－1

從表1 可知，流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣調(diào)控pH值對(duì)井岡霉素發(fā)酵效價(jià)無(wú)不利影響，甚至有一定的促進(jìn)作用，平均提高發(fā)酵效價(jià)3.6%，可在生產(chǎn)大罐上進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 20m3罐發(fā)酵試驗(yàn)的井岡霉素A發(fā)酵效價(jià)

采用5m3罐流加補(bǔ)氨水井岡霉素發(fā)酵試驗(yàn)工藝，在20m3罐內(nèi)進(jìn)行了井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)大罐的穿插對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)罐與對(duì)照罐交替進(jìn)罐各10批，結(jié)果見(jiàn)表2 。

從表2 可知，流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣調(diào)控pH值對(duì)井岡霉素發(fā)酵效價(jià)無(wú)不良影響。

2.3 流加補(bǔ)氨水發(fā)酵對(duì)井岡霉素提取收率的影響

將流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣調(diào)控發(fā)酵pH值的井岡霉素生產(chǎn)大罐在后提取中采用膜分離濃縮工藝的試驗(yàn)罐批與采用傳統(tǒng)薄膜濃縮工藝的對(duì)照罐批進(jìn)行井岡霉素A提取收率的對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3 。

表2 20m3罐流加補(bǔ)氨水與對(duì)照的井岡霉素A發(fā)酵效價(jià)比較Tab.2 Comparison of Jinggangmycin fermentation titers for fed－batch ammonium feeding and the contrast in 20m3tank

表3 膜分離濃縮工藝和傳統(tǒng)薄膜濃縮工藝井岡霉素A提取收率的比較Tab.3 Comparison of Jinggangmycin extraction yield for membrane separation and concentration process and traditional thin－membrane concentration process

從表3 可知，試驗(yàn)罐批比對(duì)照罐批的濃縮收率提高了6.8%，水劑總收率提高了6.2%，證明流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣調(diào)控發(fā)酵pH值的井岡霉素發(fā)酵料液后提取采用膜分離濃縮工藝的效果更好。

2.4 討論

由于鈣離子容易造成列管結(jié)垢，采用傳統(tǒng)的薄膜濃縮工藝時(shí)井岡霉素料液在濃縮過(guò)程中溫度較高、耗時(shí)長(zhǎng)，不僅耗汽量大，而且對(duì)產(chǎn)品濃縮收率有很大的影響，提取成本較高。膜分離濃縮是在常溫下工作，對(duì)產(chǎn)品的有效成分沒(méi)有破壞作用，具有濃縮效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11，12］。流加補(bǔ)氨水井岡霉素發(fā)酵避免了碳酸鈣的影響，使膜分離濃縮工藝代替薄膜濃縮工藝可行，對(duì)提高井岡霉素提取收率、降低成本有利。

為了制備井岡霉素高含量粉劑（原藥）產(chǎn)品，必須首先得到無(wú)沉淀物且低鹽的井岡霉素高濃度水劑（20%以上），然后以該高濃度水劑產(chǎn)品為基礎(chǔ)，通過(guò)樹(shù)脂吸附、納濾除鹽、刮板濃縮、噴霧干燥等工序，最終得到井岡霉素高含量粉劑（原藥）產(chǎn)品。但由于薄膜濃縮只能蒸發(fā)水分，往往最后導(dǎo)致高濃度水劑中鹽分超標(biāo)。而膜分離濃縮具有除鹽效果，能在濃縮過(guò)程中除去料液中約25%的無(wú)機(jī)鹽，從而有效降低高濃度水劑產(chǎn)品中的鹽分含量，為順利制備井岡霉素高含量粉劑（原藥）產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用流加補(bǔ)氨水代替碳酸鈣用于井岡霉素生物發(fā)酵調(diào)控pH值的工藝，對(duì)井岡霉素菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物分泌無(wú)不良影響；可精確調(diào)控發(fā)酵pH值，使得菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物分泌在最適pH值環(huán)境下進(jìn)行，同時(shí)，因消除了鈣離子對(duì)膜分離濃縮的影響，保證了膜分離濃縮工藝的順利實(shí)施，可顯著提高井岡霉素提取收率。該工藝可以推廣到大規(guī)模生產(chǎn)，具有非常顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

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