3種真菌直接鏡檢溶液診斷甲真菌病的比較研究

陽 眉，蘭長貴，梅曉鋒

（核工業四一六醫院皮膚性病科，成都 610051）

真菌鏡檢是實驗室診斷皮膚真菌病最常用的方法，10%～30%氫氧化鉀（KOH）溶液是常規使用的角質溶解劑［1］，但對于指、趾甲標本，甲屑不易溶解。為了更快、更準確地診斷病指、趾甲中的真菌，作者于2010年3～8月采用10%KOH溶液（第1組）、20%KOH溶液（第2組）、20%KOH與40%二甲基亞砜（DMSO）復合溶液（第3組）3種溶液對60例指、趾甲標本進行單盲對照研究，以真菌培養為金標準，比較分析3種溶液診斷指、趾甲標本真菌的敏感性、特異性、陽性率以及真菌菌絲平均顯現時間，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選共60例標本，指甲標本24例，趾甲標本36例，其中男32例，女28例。平均年齡（42.3±13.1）歲。病程2周至20年，平均（8.2±2.3）月。入選標準：臨床懷疑甲真菌病患者，年齡、性別不限。排除標準：就診前1個月內系統或外用抗真菌藥物。

1.2 材料 10%KOH 溶液、20%KOH溶液、20%KOH與40%DMSO復方溶液、沙保培養基［1］。

1.3 方法 75%的乙醇消毒病甲表面，用鈍刀刮取甲下鱗屑，將碎屑標本均勻分成4份，其中3份標本分別置于3張新玻片上，用3種溶液分別滴加在玻片上，閱片并計時，記錄真菌菌絲顯現的時間直至30min；1份接種在沙保培養基27℃培養4周，依據形態學、生化反應鑒定菌種［1］。以培養結果作為診斷金標準。

1.4 單盲設計方法 由一名醫生分別用3種溶液制片并編號，另一名醫生統一閱片并記錄結果，閱片者不知曉試劑成分，對閱片者采用單盲設計，減少觀察過程中的偏倚。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析，率的比較用χ2檢驗，平均時間比較用t檢驗，檢驗水準α取0.05。

2 結 果

2.1 3種真菌鏡檢溶液鏡檢及培養結果 在60例指、趾甲標本中，3種真菌鏡檢溶液鏡檢陽性例數分別為32、39、40例；鏡檢和培養同時陽性例數分別為28、36、38例，呈逐漸增加。60例指、趾甲標本中真菌培養陽性46例，陰性14例。3種真菌鏡檢溶液各鏡檢和培養結果見表1。

表1 3種溶液鏡檢及培養結果（n＝60）

2.2 3種溶液的敏感性、特異性和陽性率 見表2。將3組溶液的敏感性進行χ2檢驗，結果顯示第1組與第2組比較χ2＝3.286，Р＝0.07；第2組與第3組比較χ2＝0.276，Р＝0.599；第1組與第3組比較χ2＝5.361，Р＝0.021。第1組與第2組、第2組與第3組敏感性差異無統計學意義，第1組與第3組敏感性有差異。3組溶液的特異性χ2＝0.848，Р＝0.654；陽性率χ2＝2.679，Р＝0.262，差異無統計學意義。

表2 3種溶液敏感性、特異性、陽性率（%）

2.3 3種溶液真菌菌絲平均顯現時間 分別為（12.2±9.642）、（10.7±8.641）、（6.8±6.268）min。t檢驗顯示第1組與第2組比較，t＝0.715；第2組與第3組比較，t＝0.263；第1組與第3組比較，t＝0.149，差異均有統計學意義。

2.4 真菌培養結果 分離出46株真菌，其中紅色毛癬菌34株，須癬毛癬菌5株，石膏樣小孢子菌2株，犬小孢子菌1株，白色念珠菌4株。皮膚癬菌仍是甲真菌病的主要致病菌。

3 討 論

指、趾甲真菌病的診斷傳統方法有KOH直接鏡檢和真菌培養。KOH直接鏡檢簡單、價廉，但約有5%～15%呈假陰性［2］。真菌培養能鑒定菌種，特異性高于KOH鏡檢，但真菌培養時間長，若標本中真菌成分無活性可出現假陰性［3－5］。其他方法包括PAS染色、熒光白染色、體內共聚焦顯微鏡、聚合酶鏈反應、流式細胞術均應用于診斷，但多限于在相關的實驗室［2－5］。因而在指、趾甲真菌病指南中仍以真菌的培養作為診斷指、趾甲真菌病的“金標準”［6］。

真菌鏡檢溶液中KOH堿性強，能軟化和溶解角蛋白、脂肪及其他組織碎屑，使真菌形態清晰，1971年Rebell等發現加入DMSO后可以快速溶解角質而不需加熱，更容易辨認真菌的結構，并能與人工假象相區別［5］。通過提高KOH濃度及添加滲透劑二甲基亞砜，促進角質細胞化學變性，使背景清楚，減少纖維織物和細胞間隙干擾，易于辨認，特別是針對指、趾甲標本有其優越性。

本研究發現加入了DMSO的KOH溶液能在10min內溶解指、趾甲標本，而10%KOH溶液溶解角質時間為10min以上。有學者研究對于皮屑標本甚至可在5min內完全溶解［3］。本研究結果顯示，3種溶液特異性和陽性率差異無統計學意義，但20%KOH與40%DMSO復方溶液對指、趾甲標本有更高的敏感性，真菌顯現更清楚，時間短，更助于真菌的識別，可以作為真菌鏡檢的篩選溶液。

本研究中指、趾甲屑標本取材部位的選擇，標本量足夠多，顆粒足夠細是保證真菌鏡檢和培養成功重要因素，同時若對真菌成分進行濃縮或著色，鏡檢能更易分辨。

［1］ 吳紹熙.現代醫學真菌檢驗手冊［M］.北京：北京醫科大學／中國協和醫科大學聯合出版社，1998：52-53，72.

［2］ Panasiti V，Borroni RG，Devirgiliis V，et al.Comparison of diagnostic methods in the diagnosis of dermatomycoses and onychomycoses［J］.Mycoses，2006，49（1）：26-29.

［3］ Singh S，Beena PM.Comparative study of different microscopic techniques and culture media for the isolation of dermatophytes［J］.Indian J Med Microbiol，2003，21（1）：21-24.

［4］ Dass，Goyal R，Bhattacharya SN.Laboratory-based epidemiological study of superficial fungal infections［J］.J Dermatol，2007，34（4）：248-253.

［5］ Wilsmann-Theis D，Sareika F，Bieber T，et al.New reasons for histopathological nail-clipping examination in the diagnosis of onychomycosis［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25（2）：235-237.

［6］ Reisberger EM，Abels C，Landthaler M，et al.Histopathological diagnosis of onychomycosis by periodic acid-Schiffstained nail clippings［J］.Br J Dermatol，2003，148（4）：749-754.