微波制備γ－干擾素處理的小鼠H22肝癌細胞瘤苗的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，楊 寧，連相堯（承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000）

由于腫瘤的抗原性較弱，表達的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex class I，MHC-I）較少或缺失，因此腫瘤細胞可以逃避機體的免疫攻擊。γ－干擾素（IFN-γ）是由T細胞分泌的一種多功能調節因子，可通過誘導MHC-I類抗原的表達、增加肽轉運相關蛋白的穩定性、誘導某些細胞表面黏附分子的表達（如ICAM-1、LFA-1）增強腫瘤細胞的抗原遞呈能力［1－2］。微波作為抗原修復的方法已廣泛應用于免疫組織化學染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復方法，它可使病理切片的抗原充分暴露，提高免疫組化染色的敏感性［3］。全細胞瘤苗可表達多種腫瘤抗原［4］，因此用IFN－γ處理H22腫瘤細胞，再用微波制備全細胞瘤苗，既消除了它的致瘤性，又增強了其抗原性，且操作簡單。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8周齡健康BALB／C小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，小鼠體質量14～16g，常規飼養。

1.1.2 腫瘤細胞 H22瘤株由白求恩醫科大學提供，液氮凍存。使用時37℃水浴融解后，RPMI-1640培養液洗3遍，接種于含10%胎牛血清（FBS）的1640培養基，培養至對數生長期，收集細胞接種于BALB／C小鼠腹腔傳代。

1.2 微波制備IFN-γ處理的 H22肝癌細胞瘤苗（MITTVH22）的制備 收集BALB／C小鼠腹腔積液H22腫瘤細胞，1640培養液洗2遍，用H22腫瘤細胞培養液培養，加入IFN-γ（200U／mL）37℃5%CO2培養48h。收集H22腫瘤細胞，用生理鹽水洗2遍，制成2.5×106／mL的H22細胞懸液，微波照射20s（750w、2 450MHz），臺盼藍染色后光鏡下觀察證實H22腫瘤細胞被全部滅活，制成MITTV-H22，4℃儲存備用。

1.3 實驗分組與動物模型的制備 60只小鼠檢疫10d后隨機分成 A、B、C、D、E、F 6組，每組各10只。實驗組（A、C、E）小鼠右后肢外側皮下接種 MITTV-H22（2.5×106／mL）0.2 mL進行免疫，每周免疫1次，共3次。對照組（B、D、F）小鼠用生理鹽水代替MITTV-H22進行免疫。實驗組（A、C）與對照組（B、D）均于末次免疫后第7天，接種 H22腫瘤細胞（1×106個）于右腋皮下。A、B兩組用于觀察小鼠生存情況，觀察120d。C、D兩組于H22腫瘤細胞接種后的第7天取瘤塊測量體積。瘤塊體積的計算公式為：V＝0.4×a×b2（a為長軸，b為短軸）［5］。E、F兩組于末次免疫后第10天，做脾淋巴細胞增殖實驗（MTT）。無菌取小鼠脾臟，用淋巴細胞分離液按常規分離脾淋巴細胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液調成濃度為1×107／mL的脾細胞懸液，加入96孔細胞培養板，每孔1×105個淋巴細胞，于刺激細胞H22孔加入多聚甲醛處理的H22腫瘤細胞1×104個，37℃5%CO2培養箱中共培養8h。8h后每孔加入20μL（5mg／mL）MTT溶液再孵育4h。2 000r／min室溫離心10min，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，震蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀上測OD值（測定波長570nm）。

刺激指數（SI）＝（自發轉化孔OD值－刺激細胞H22孔OD值）／自發轉化孔OD值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 15.0軟件對腫瘤體積進行重復測量設計的方差分析，其他資料均用2個獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠生存期 對照組小鼠平均生存期為（31.87±5.87）d，實驗組小鼠120d時的生存率為80%，生存期明顯延長，明顯長于對照組（t＝25.55，P＜0.01）。見表1。

2.2 腫瘤生長情況 實驗組小鼠于接種H22腫瘤細胞的第7天接種部位沒有發現肉眼可見的包塊，解剖觀察腫瘤接種部位亦未發現瘤塊；120d后經解剖也沒有發現腫瘤組織。對照組于接種H22腫瘤細胞后的5～6d接種部位出現直徑小于0.5 cm的包塊，成瘤率為100%；接種后7d，腫瘤的平均體積為（4.8±1.0）mm3。

2.3 脾淋巴細胞SI MTT法檢測結果顯示，實驗組小鼠的SI顯著高于對照組，差異具有統計學意義（t＝3.526，P＜0.01）。見表1。

表1 小鼠生存期、腫瘤體積和淋巴細胞刺激指數比較（x±s）

3 討 論

多數腫瘤主要組織相容性復合體I（MHC-I）類分子表達明顯減少或缺失，使CTL不能識別腫瘤細胞的抗原，腫瘤細胞從而得以逃避宿主的免疫攻擊。MHC-I類抗原表達減少或消失與腫瘤細胞去分化有關，使T細胞識別腫瘤抗原受阻，不能起到有效的殺腫瘤效應［6］。IFN是調節MHC-I類分子高表達的重要生物因子［7－9］。Ⅰ型和Ⅱ型IFN均可引起 MHC-I類抗原表達增高，而IFN－γ的作用更強，IFN-γ由T細胞產生，能直接抑制腫瘤細胞增殖、增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子的表達、抗腫瘤血管生成等［10］。

腫瘤細胞逃避機體免疫攻擊的另一原因是腫瘤細胞表面“抗原覆蓋”或被封閉。“抗原覆蓋”是指腫瘤細胞表面抗原可能被某些物質所覆蓋，如腫瘤細胞可表達高水平的唾液黏多糖或表達腫瘤激活的凝聚系統，這兩種成分均可覆蓋腫瘤抗原。腫瘤抗原可經糖基化等方式隱藏，這一過程稱為抗原遮蔽。微波作為抗原修復的方法已廣泛應用于免疫組織化學染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復方法［11－13］。微波可使病理切片的抗原更充分地暴露，提高免疫組化染色的敏感性。

本研究使用的小鼠肝癌細胞株H22的MHC－Ⅰ表達缺失，且腫瘤抗原性弱。IFN-γ和微波共同處理H22腫瘤細胞制備瘤苗MITTV-H22，既消滅了致瘤性又增加了表面 MHC－Ⅰ類抗原的表達，提高其抗原遞呈能力和抗原性。初步研究發現：（1）實驗組小鼠的SI明顯高于對照組；（2）實驗組小鼠于H22腫瘤細胞攻擊7d時沒有發現肉眼可見的腫瘤組織，120 d后經解剖也沒有發現腫瘤組織，對照組于H22腫瘤細胞攻擊后第5天即發現肉眼可見的瘤塊。說明MITTV-H22的抗原性有了很大的提高，能有效地激活機體的免疫系統，對H22細胞型腫瘤具有很強的預防作用。

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