海綿和海鞘中可培養放線菌的分離與多樣性比較

楊 琪, 信艷娟, Christopher FRANCO, 柯才煥, 張 衛,,

(1. 廈門大學 海洋與地球學院, 福建 廈門 361005; 2. 中國科學院 大連化學物理研究所海洋生物產品工程實驗室, 大連 116023; 3. Flinders Centre for Marine Bioproducts Development; 4. Department of Medical Biotechnology, School of Medicine, Flinders University, Adelaide, South Australia, 5042, Australia)

隨著陸棲微生物在抗生素、酶、酶抑制劑和多糖等生物活性物質方面的大規模開發和應用, 通過尋找新種屬或特殊性狀的微生物來開發新型天然活性物質的難度越來越大。近年來研發重點轉向了前景更為廣闊而研發較少的海洋微生物資源, 并成為海洋生物技術開發的主要內容。作為海洋微生物資源開發的前提, 海洋微生物多樣性的研究得到了迅速發展[1]。

海綿動物是迄今已知海洋天然產物的最大來源。由于海綿的底棲過濾性攝食和選擇性消化等生理特性, 其體內蘊藏了豐富的微生物, 同時海綿中分離得到的豐富天然產物有許多是由其共生微生物產生的[2]。目前海綿相關微生物多樣性和活性產物的研究已經獲得了很多成果。與活躍的海綿相關微生物研究相比較, 同屬于濾食性海洋無脊椎動物的海鞘動物, 雖然已從其體內發現了多種生理活性物質[3], 但是其相關微生物多樣性的研究仍處于起步階段, 研究報道極少。放線菌是一大類有生理活性的次級代謝產物的生產者, 目前所使用的抗生素中, 70%是由放線菌產生, 并且來源于海洋微生物的活性物質中有一半以上來自放線菌[4]。

因此, 真正全面認識海鞘相關放線菌的多樣性,將海綿相關放線菌多樣性研究方法應用于海鞘, 比較兩種動物相關放線菌多樣性水平之間的差異, 獲得更多的放線菌資源并加以開發應用,是一個很有價值的研究課題。作者選取地域差別較大的中國福建東山灣海域的海綿(山海綿和網架海綿)和中國海南陵水海域的海鞘(皺瘤海鞘和乳突皮海鞘)為研究對象, 比較不同種屬之間及不同物種之間相關放線菌多樣性差異和特異性關系, 驗證海鞘具有高的相關放線菌多樣性及存在種屬間差異的理論假說, 證明海鞘可作為除海綿之外另一個極具潛力的海洋放線菌和天然活性產物的來源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

海綿活體樣本采自福建古雷東山灣附近海域潮間帶, 經鑒定為山海綿科(Mycalidae)的山海綿屬(Mycalesp.)(圖 1-A)和網架海綿科(Dictyonellidae)的網架海綿屬(Stylissasp.)(圖1-B)。海鞘活體樣本采自海南陵水縣附近水域, 經鑒定為皺瘤海鞘(Styela plicata)(圖1-C)和乳突皮海鞘(Molgula manhattensis)(圖 1-D)。

1.2 培養基和試劑

根據文獻[5]報道, 選擇4種有效放線菌分離培養基進行改良, 制備 M1-M4, 另選用放線菌通用培養基高氏一號和細菌通用培養基2216E, 成分見表1。

Taq DNA聚合酶, HhaI(10 U/μL)由BioLabs提供;DNA純化試劑盒由 Mo BIO提供; DNA Marker由TakaRa提供; 16S rRNA 基因擴增引物 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、765R (5’- CTGT TTGCTCCCCACGCTTTC-3’)、704F (5’- GTAGCG GTGAAATGCGTA-3’)和 1492R (5’- CGGCTACCTT GTTACGAC-3’)由 GeneWorks提供。

圖1 海綿和海鞘樣品照片Fig. 1 Photos of sponges and ascidians

表1 海綿和海鞘放線菌分離培養基及其成分[5]Tab.1 Composition of six different kinds of media used for the isolation of actinomycetes from marine sponges and ascidians

1.3 海綿和海鞘中放線菌的分離、純化和保藏

將樣品在無菌條件下切塊, 洗滌, 除去表面附著的海水中微生物和其他雜質; 稱量樣品5.0 g加入5 mL無菌海水研成勻漿, 為0 #菌液。取1 mL 0#菌液加入9 mL無菌海水制成1 #菌液, 同樣方法制備2#菌液。分別取上述菌液 200 μL涂布培養基平板,每種濃度的菌液涂 3個平板; 置于 28℃培養箱中倒置培養7天左右, 觀察菌落生長情況。當出現放線菌菌落后, 挑取單菌落劃線, 重復分離直至獲得純化菌株。挑取純化單菌落加入裝有1.8 mL 20%甘油水溶液的凍存管中, -80℃保藏。

1.4 基因組DNA提取和16S rRNA基因的PCR擴增

取純化放線菌菌株2～3環, 采用改良細菌基因組DNA提取方法提取放線菌基因組DNA[6]。用兩對引物27F和765R、704F和1492R分別擴增16S rRNA基因。PCR 反應體系(50 μL): 5 μL 10 × ThermoPol Buffer, 1 μL dNTPs(各 10 mmol/L), 1 μL 引物27F(704F)和 1 μL 765R(1492R)(20 μmol/L), 2 μL 模板DNA(≥200 ng), 1 μL TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)和 39 μL的純水。PCR反應條件: 94℃, 2 min; 94℃, 1 min, 52℃,1 min, 72℃, 2 min, 40個循環; 72℃, 延伸10 min; 以20℃終止反應。

1.5 16S rRNA基因限制性片斷長度多態性分析(RFLP)和序列分析

16S rRNA基因擴增產物在限制性內切酶 HhaI作用下于37℃反應16 h, 進行瓊脂糖凝膠電泳。同時16S rRNA基因擴增產物經純化后進行測序分析。測序結果與NCBI的GenBank進行Blast比對, 用序列分析軟件MEGA5.1構建系統發育樹。

2 結果

2.1 菌株分離

根據菌落形態特征以及菌株基絲、氣絲的形態特征, 可判斷用 6種有效的分離培養基從山海綿和網架海綿中分別分離出放線菌 51株和 36株, 共計87株; 從皺瘤海鞘和乳突皮海鞘中分別分離得到放線菌80株和31株, 共計111株(表2)。

表2 海綿和海鞘在不同培養基中分離得到的放線菌數量Tab. 2 The number of actinobacteria isolated from sponges and ascidians in different isolation media

2.2 RFLP分析

將 198株放線菌的 16S rRNA基因進行 HhaIRFLP分析。結果表明, 198株菌可分成38個RFLP圖譜類型(部分代表帶型見圖2-A和圖2-B), 有效的RFLP分組能將菌株初步歸類, 為選擇代表性菌株進行測序提供依據。結合RFLP帶型和測序結果繪制表3和表4。

2.3 16S rRNA基因序列分析

圖2 網架海綿和皺瘤海鞘部分相關放線菌16S rRNA基因的RFLP代表性結果Fig. 2 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)analysis of some representative actinobacteria isolated from marine sponge Stylissa sp. and marine ascidian Styela plicata

將測得的序列信息分別輸入 GenBank中比較,進行屬一級的歸類, 并構建系統發育樹(圖3～圖6)。

表3 海綿相關放線菌16S rRNA基因的序列分析和RFLP分析Tab. 3 Sequence and RFLP analysis of 16S rRNA gene of actinobacteria from marine sponges Mycale sp. and Stylissa sp.

表4 海鞘相關放線菌16S rRNA基因的序列分析和RFLP分析Tab.4 Sequence and RFLP analysis of 16S rRNA gene of actinobacteria from marine ascidians Styela plicata and M. manhattensis

續表

圖3 山海綿放線菌16S rRNA基因序列N-J系統發育樹分析Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Mycale sp. and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

測序結果表明, 55株代表性放線菌(從典型RFLP帶型和各種屬獨有帶型組中挑選)中有 12株屬于稀有放線菌, 其他屬于鏈霉菌, 該菌屬在 4個樣品中都表現出豐富的種類。12株稀有放線菌分屬以下7個屬: 擬諾卡氏菌、戈登菌、微桿菌、短桿菌、紅球菌、小單孢菌和節細菌。其中山海綿中得到擬諾卡氏菌、節細菌、戈登菌和微桿菌屬, 網架海綿中得到短桿菌; 皺瘤海鞘中得到擬諾卡氏菌、戈登菌、微桿菌、短桿菌和紅球菌, 乳突皮海鞘中得到小單孢菌。

圖4 網架海綿放線菌16S rRNA基因序列N-J系統發育樹分析Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Stylissa sp. and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

3 討論

微生物與海鞘共生的現象能夠使海鞘產生具有活性的次級代謝產物, 有很多是具有價值的藥用化合物[7-9], 表現出抗腫瘤、抗病毒、抗微生物等生理活性, 以抗腫瘤活性最為引人注目[3]。但至今, 除證實海鞘有共生藍藻細菌外[10], 其相關微生物的研究并不多。文獻中應用培養方法獲得了一種海鞘的微生物群落信息以及一些分離菌株[11-13]。但由于培養分離方法的局限性, 只能檢測到存在于特定生存環境中的少數微生物[14-15]。利用 DGGE、克隆和 16S rRNA基因測序等分子手段分析微生物群落, 發現似螺原體細菌在乳突皮海鞘的生殖腺中大量存在[16]。但文獻中對海鞘相關放線菌的報道極少。

本研究探討了海鞘中相關放線菌的多樣性, 是目前為止極少數海鞘相關微生物多樣性報道中專門針對放線菌的研究。Menezes等[17]用7種添加營養豐富的人工海水并減少碳源的分離培養基從海鞘Didemnumsp.中分離出3個放線菌屬: 短小桿菌、微球菌和戈登菌。從海鞘Didemnum Ligulum中分離出4個放線菌屬: 短小桿菌、節細菌、短桿菌和諾卡氏菌。而本研究從皺瘤海鞘中分離出6個放線菌屬, 從乳突皮海鞘中得到 2個放線菌屬, 可初步驗證海鞘具有高的放線菌多樣性, 且存在顯著的種屬間差異,其中皺瘤海鞘相關放線菌的多樣性是目前為止海鞘個體中可培養放線菌多樣性最高的研究結果。可見分離培養結合 16S rRNA基因測序的方法能很好的揭示海鞘相關放線菌的多樣性, 并且所選用的 6種分離培養基能夠有效分離海鞘中相關放線菌, 優于其他研究中的分離培養基。

圖5 皺瘤海鞘放線菌16S rRNA基因序列N-J系統發育樹分析Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Styela plicata and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

海綿來源的放線菌多樣性研究已經廣泛開展,目前已分離出纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、酸微菌屬(Acidimicrobium)、考克氏菌屬(Kocuria)、疣胞菌屬(Verrucosispora)等22個屬[18]。張海濤等[19]用16S rRNA基因擴增和RFLP及測序分析相結合的方法從大連海域繁茂膜海綿中分離出 7個放線菌屬。信艷娟等從大連海域繁茂膜海綿中篩選放線菌 9個屬[2],是目前多樣性最高的研究結果。本研究從山海綿中分離出5個放線菌屬, 網架海綿中分離出2個放線菌屬, 雖然數量并不是最多, 但可表明海綿相關放線菌高的多樣性水平。進而與海鞘相關放線菌多樣性平行對比, 證明海鞘中具有豐富的放線菌資源, 在本研究中還表現出高于海綿來源的放線菌多樣性, 是一種很有潛力的放線菌來源。同時, 海鞘中發現8種可能的新放線菌菌株, 數量上遠高于在海綿(2種)中的發現。

比較海綿之間、海鞘之間相關放線菌多樣性, 可發現無論數量上還是多樣性水平上都存在顯著性差異(表3和表4)。這可能與其生長環境和生理結構的差異有密切關聯。質地松軟, 濾水系統發達, 生活于潮間帶的山海綿比質地堅硬、骨針結構多的網架海綿更易富集海水中的微生物, 同時表面粗糙的皺瘤海鞘則比表皮光滑透明的乳突皮海鞘容易積累微生物, 因而表現出更高的可培養放線菌多樣性。但是,更重要的原因是研究手段的局限性, 分離培養手段無法獲得稀有的難培養的種類。高濃度的營養物質可能比較適合生長速度快且對高濃度營養物質有適應能力的放線菌, 但對生長速度較慢的放線菌則可能有抑制作用[20-21]。特別是放線菌可以“活的非可培養”狀態存在[22], 這更增加了培養難度。因此, 基于目前使用的分離培養方法并不能全面準確的反映海綿和海鞘中放線菌的多樣性信息, 仍需應用新的分子多樣性研究與培養相結合的方法進一步深入研究。

圖6 乳突皮海鞘放線菌16S rRNA基因序列N-J系統發育樹分析Fig. 6 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with M. manhattensis and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

Li等[23]和 Webster等[24]都利用添加海綿組織提取液的放線菌培養基, 成功分離到稀有放線菌以及先前沒有分到的菌株。這也為今后的分離培養研究提供了可選擇的思路。同時也需結合分子生物學的研究手段從基因角度分析, 與分離培養方法互為補充, 提供分子信息指導, 以期獲得更全面更準確的海綿和海鞘相關放線菌多樣性信息, 真正驗證海鞘相關放線菌的多樣性及其特有的新菌種資源。

4 結語

作者用 6種有效的分離培養基從兩種海綿和兩種海鞘中分別分離出87株和111株放線菌, 其中有10株為潛在的新菌株, 為海洋放線菌的開發利用提供了潛在的新資源。與海綿中分離得到的 6個放線菌屬和2個可能的新菌株相比, 從海鞘中分離到了7個放線菌屬和 8個可能的新株。表明海鞘具有較高的放線菌多樣性水平, 是除海綿之外另一個極具潛力的海洋放線菌來源, 可成為開發海洋未知放線菌菌株以及海洋天然活性產物的新方向和儲備資源。

[1]李越中, 陳琦. 海洋微生物資源多樣性[J]. 生物工程進展, 1998, 18(4): 34-40.

[2]信艷娟, 吳佩春, 鄧麥村, 等. 繁茂膜海綿中可培養稀有放線菌的多樣性[J]. 微生物學報, 2009, 49(7):859-866.

[3]耿越, 張薛, 趙相軒. 海鞘類天然物的最新研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2001, 13(6):73-78.

[4]Takahashi Y, Omura S. Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds[J].Gen Appl Microbiol,2003, 49: 141-154.

[5]Zhang H T , Lee Y K, Zhang W, et al. Culturable actinobacteria from the marine spongeHymeniacidon perleve: isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis[J]. Anton Leeuw,2006, 90:159-169.

[6]Lee Y K, Kim H W, Liu C L, et al. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials[J]. J Microbiol Meth, 2003, 52:245-250.

[7]Pisut D P, Pawlik J R. Anti-predatory chemical defenses of ascidians: secondary metabolites or inorganic acids?[J]. Exp Mar Biol Ecol, 2002, 270:203-214.

[8]Moss C, Green D H, Pérez B, et al. Intracellular bacteria associated with the ascidianEsteinascidia turbinata: phylogenetic and in situ hybridization analysis[J]. Mar Biol, 2003, 143: 99-110.

[9]Ramasamy M S, Murugan A. Chemical defense in ascidiansEudistoma virideandDidemnum psammathodesin Tuticorn, southeast coast of India: bacterial epibiosis and fouling deterrent activity[J]. Indian J Mar Sci, 2003,32: 337-339.

[10]Hirose E, Maruyama T, Cheng L, et al. Intra- and extracellular distribution of photosynthetic prokaryotes,Prochloronsp. in a colonial ascidian: ultrastructural and quantitative studies[J]. Symbiosis,1998, 25,301-310.

[11]Olgin Uribe G, Abou Mansour E, Boulander A, et al.6-bromoindole-3-carbaldehyde form andAcinetobactersp.bacterium associated with the ascidianStomozoa murrayi[J]. Chem Ecol, 1996, 23, 2507-2521.

[12]Wahl M. Bacterial epibiosis on Bahamian and Pacific ascidians[J]. Exp Mar Biol Ecol,1995, 191, 239-255.

[13]Romanenko L A, Shumann P, Rhode M, et al.Halomonsa halocynthiaesp. nov. isolated form the marine ascidianHalocynthia auranticum.Int[J]. Syst Evol Microbiol,2002,52: 1767-1772.

[14]Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiol Rev,1995, 59: 143-169.

[15]Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J].Microb Ecol, 1998, 35: 1-21.

[16]Elia T, Mary C, Stefan M, et al. Phylogenetic diversity of bacteria associated with ascidians in Eel Pond(Woods Hole, Massachusetts, USA)[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2007, 342: 138-146.

[17]Menezes CBA, Bonugli-Santos RC. Microbial diversity associated with algae, ascidians and sponges from the north coast of Sao Paulo state, Brazil[J]. Microbiol Res,2010, 165: 466-482.

[18]Taylor M W, Mohamed N M, Enticknap J J, et al.Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology and biotechnological potential[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2007, 71: 295-347.

[19]張海濤, 靳艷, 虞星炬, 等. 16S rDNA-RFLP分析繁茂膜海綿可培養放線菌的多樣性[J]. 微生物學報,2005, 45(6): 828-831.

[20]岳秀娟, 余利巖. 自然界中難分離培養微生物的分離和應用[J]. 微生物學通報, 2006, 33(3): 77-8l.

[21]張曉華. 海洋微生物學[C]. 青島: 中國海洋大學出版社, 2007, 332-333.

[22]薛超波, 王國良, 金珊, 等. 海洋微生物多樣性研究進展[J]. 海洋科學進展, 2004, 22(3): 377-384.

[23]Li Z Y, Liu Y. Marine sponge Craniella austrialiensis associated bacterial diversity revelation based on 16S rDNA library and biologically active actinomycetes screening,phylogenetic analysis[J]. Lett Appl Microbiol, 2006, 43:410-416.

[24]Webster N S, Wilson K J, Blackall L L, et al.Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine spongeRhopaloeides odorabile[J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 434-444.