藍隱藻藻藍蛋白結構與功能穩(wěn)定性研究

李文軍, 陳 敏

(煙臺大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264005)

藻膽蛋白是存在于藍藻、紅藻、部分隱藻和甲藻中的捕光色素蛋白復合物, 它們吸收 500～650 nm的可見光, 并將吸收的光能傳遞給膜上的反應中心進行光合作用。由于藻膽蛋白在可見光區(qū)和近紫外區(qū)都有明顯的特征吸收, 并且具有很高的熒光量子產率, 作為一個天然內標, 其色基與蛋白質之間的結合狀態(tài)以及蛋白質所處的內部微環(huán)境的微小變化,都可以在其光譜性質上呈現出很靈敏的反映, 因此是研究蛋白質結構與功能關系的難得材料。

隱藻是一類單細胞、結構較為復雜的雙鞭毛藻類,在淡水和海水中都有分布[1]。每種隱藻只含有一種藻膽蛋白[2], 或者藻藍蛋白(PC)或者藻紅蛋白(PE)。目前, 對于紅、藍藻中的藻膽蛋白, 無論結構、性質以及組裝而成的藻膽體等, 都有相當透徹的研究, 但是對于隱藻藻膽蛋白卻了解較少, 其蛋白亞基的性質、彼此之間的組裝和連接方式, 以及與膜上反應中心的接觸等情況, 目前都不完全確定[3]。本文使用的藍隱藻(Chroomonas placiodea)只含有一種藻藍蛋白PC-645。據報道, PC-645含有α1、α2和β三種亞基, 通過半胱氨酸的硫醚鍵共價連接多個色素基團, 包括藻藍膽素(phycocyanobilin,PCB),藻紫膽素(phycobiliviolin, PXB)和在長波端697 nm有最大吸收的一種色素基團(mesobiliverdin, 也稱MBV)。色基吸收的光能從PXB經PCB、MBV, 最終傳遞給膜上的葉綠素[4]。PC-645亞基通過折疊形成球形的三級結構, 并以(α1β)(α2β)異二聚體方式形成四級結構, 為色素基團提供了穩(wěn)定的內環(huán)境, 并且使其相互靠近, 從而保證能量傳遞功能的實現[5]。目前對藻膽蛋白結構、功能和重折疊的研究只限于紅、藍藻藻膽蛋白, 而對隱藻藻膽蛋白尚未有報道。由于隱藻藻膽蛋白是位于類囊體膜內側或堆積在膜腔中[6-7], 而不是伸展在葉綠體基質中,伴隨著光合作用過程中葉綠體內環(huán)境的變化, 其結構和構象的變化與位于基質中的紅、藍藻藻膽蛋白必然有所不同, 并可能導致其能量傳遞效率的改變。為此, 本文以藍隱藻(C.placiodea)PC-645為材料, 在不同 pH和不同質量濃度尿素中, 通過對熒光光譜、吸收光譜的監(jiān)測,研究藍隱藻 PC-645蛋白的變性和復性動力學, 以及蛋白結構和能量傳遞功能的關系。

1 材料與方法

1.1 PC-645樣品制備

藍隱藻(C. placiodea)的培養(yǎng)和PC-645的制備、純化方法參照文獻[8]。純化的80%硫酸銨沉淀的PC-645,經 Pall 30kDa超濾管濃縮, 并調整蛋白質量濃度為50 g/L待用。以下操作全部于室溫、弱光下進行。

1.2 pH變性及復性實驗

采用0.1 mol/L的HCL或0.1 mol/L的NaOH溶液調節(jié) 0.2 mmol/L的磷酸氫二鉀緩沖液 pH, 經HANNA PH211臺式酸度計檢測, 配制成不同pH緩沖液。將濃縮后的PC-645用相應pH的緩沖液稀釋至蛋白終質量濃度為2 g/L和0.1g/L, 渦旋混勻后放置10 min, 分別用于吸收和熒光光譜的測定[9-10]。

1.3 極端pH下時間耐受性實驗

如1.2操作, 在pH3條件下分別調節(jié)PC-645蛋白終質量濃度為2 g/L和0.1g/L, 在60 min內間隔取樣, 分別用于測定吸收和熒光光譜。

1.4 尿素變性及復性實驗

高質量濃度尿素變性實驗中, PC-645被稀釋至不同pH值的尿素溶液中, 尿素終質量濃度為8 mol/L, 蛋白終質量濃度為 2 g/L; 尿素復性實驗時, 蛋白質量濃度為2 g/L的PC-645在終質量濃度為3 mol/L的尿素(含50 mmol PBS)緩沖液中變性1h后, 置于半透膜中對純水透析除去尿素, 定時取樣測定吸收光譜。

1.5 吸收光譜測定

采用TU-1900紫外-可見分光光度計檢測, 掃描范圍250～750 nm, 蛋白終質量濃度為2 g/L, 光徑1 cm,步長1 nm。

1.6 熒光光譜測定

用 PerkinElmer LS55 熒光分光光度計檢測, 蛋白終質量濃度為0.1 g/L, 光徑1 cm。

2 pH耐受光譜動力學

2.1 吸收光譜

天然狀態(tài)下的 PC-645在可見光區(qū)有 582、625和645 nm三個特征峰吸收峰[11], 其中582 nm峰對應于PXB色基的吸收, 625 nm吸收肩峰對應于PCB,兩者以1:1關系存在于β亞基上; 而645 nm吸收對應于 MBV, 其吸收范圍可跨越 640～695 nm, 為α亞基所僅有[12]。隨著環(huán)境中pH的降低, 藻藍蛋白光吸收逐漸減弱(圖1A)。在pH低于3時, 吸光度下降非常快, 原582 nm和650 nm最大光吸收紅移, 在pH低于2.5時, 吸收峰融合為一個600～700 nm的較寬吸收峰, 可能是α亞基構象改變, MBV色基暴露的結果。PC-645的α亞基含有較多堿性氨基酸[4,13], 當外界pH環(huán)境較低時,α亞基更易于受到影響, 所帶負電荷減少, 亞基變性伸展, 結合在 Cys α19上的 MBV色基暴露, 表現吸收峰紅移。在堿性溶液中, 藻藍蛋白吸收光譜在pH 7～10時較為穩(wěn)定(圖1B), 而pH超過10.25時, 吸收光譜強度下降顯著。與酸性環(huán)境中相同的是, 582 nm最大光吸收處出現紅移; 不同的是,645 nm處最大光吸收處出現了藍移, 并且沒有屬于MBV的670～700 nm長波吸收峰顯現; 顯然α亞基在堿性條件下似乎相對穩(wěn)定。另外, 伴隨著645 nm處光吸收強度的快速下降, 582 nm處峰位的吸收值的下降則要緩慢的多。這是由于 582 nm處吸收峰來自于PXB, 相比于PCB, PXB通過β50和β61兩個半胱氨酸殘基與PC-645連接, 而PCB僅靠一個半胱氨酸殘基與PC-645 β82相連, 所以PXB表現出更高的穩(wěn)定性。當pH高于10.75時, 各個吸收峰相互融合為一個550～640 nm的峰, PC-645的特征吸收峰消失, 表明藻膽素色基所處蛋白內部的微環(huán)境構象變化, 指示藻藍蛋白亞基的三級結構已經解體[14]。

圖1 pH對PC-645吸收光譜的影響Fig.1 Effects of solvent pH on the absorption spectra of PC-645

近紫外區(qū)374 nm和340 nm是藻膽素特征吸收峰, 與色基本身的構象和狀態(tài)有關。在pH 3.25～7和pH 7～10.25之間, 374 nm和340 nm處的吸收值略有下降和浮動, 但變化幅度較小; 而到達pH 3.25以下或pH 10.25以上時, 兩個峰的吸收值迅速升高。此結果說明, 藻膽素色基所處的蛋白環(huán)境在 pH 3.25～10.25之間相對穩(wěn)定, 因而色基狀態(tài)變化有限。而當處于極酸和極堿的時候, 光吸收值的快速增高,可能是因為PC-645亞基變性伸展, 處于結構內部的藻膽素逐漸暴露, 也可能是因為pH變化對藻膽素產生了不可逆的修飾。此外, 遠紫外區(qū)屬于芳香族氨基酸的280 nm吸收峰也呈現類似的變化趨勢, 由于疏水的芳香族氨基酸通常位于蛋白質內部疏水區(qū), 因此其吸收變化也可提示蛋白構象變化的信息。

2.2 熒光光譜

圖2 pH對PC-645熒光發(fā)射譜的影響Fig.2 Effect of pH on fluorescence emission spectra of PC-645

選擇582, 625和645 nm三個波長的激發(fā)光分別對PC-645進行激發(fā)。其中582、625 nm是位于β亞基上的PXB和PCB的最大吸收, 而645 nm被認為與α亞基上的MBV有關。在PC-645內部, 色基吸收的能量將沿著 PXB→PCB→MBV 方向傳遞, 最終產生660～662 nm 的末端發(fā)射。如圖 2所示, 采用三個不同波長進行激發(fā)PC-645都只產生662 nm特征熒光,pH條件變化, 僅影響發(fā)射的熒光強度, 不影響峰的位置。在pH 3～7范圍內, 熒光發(fā)射峰強度都隨pH的降低有所降低, 但幅度很小; 當pH降低到3時, PC發(fā)射峰強度開始驟降; 而pH低于2.5時, 熒光發(fā)射峰幾近消失。在堿性范圍內, 當pH從7逐漸升到 10的過程中, 熒光強度同樣逐漸降低, 但下降速度明顯快于酸性條件; 當pH升高到10.5時,熒光強度可降至 pH7時的 50%以下。結合吸收光譜測定結果, 說明在pH 3.5～10之間時, PC-645不僅結構相對穩(wěn)定, 并且保持了較高的內部能量傳遞能力。

2.3 藻藍蛋白在極端pH下時間耐受性實驗

圖3 pH3時PC-645熒光強度(A)與吸收值(B)隨時間的變化Fig.3 Changes of the relative fluorescence intensity (A)and absorption value (B)of PC-645 with time at pH3

由于隱藻PC-645在pH ＞ 3時變性緩慢, 而pH ＜ 3時熒光光譜與吸收光譜都呈快速持續(xù)下降趨勢, 因此選擇pH3條件下, 觀測PC-645的光譜隨時間變化。如圖3所示, 在此極端酸性條件下, PC-645的熒光發(fā)射強度在10 min內迅速下降, 之后進入一個相對穩(wěn)定的平臺期,而吸收峰值在60 min內則是呈持續(xù)下降趨勢。這表明PC-645在 pH3條件下, 其能量傳遞功能的消失和蛋白空間結構的變化并非同步過程, 能量傳遞功能的失去先于結構變化。因為亞基解離、三級或者二級結構解體、色基修飾等結構變化是一個復雜的動態(tài)過程, 過程中任何一步都可能影響到色基的相對距離和排布, 導致能量傳遞功能喪失。因此, 為了獲得穩(wěn)定、重復的光譜測定結果, 實驗中變性時間嚴格控制為10 min。

2.4 藻藍蛋白在pH復性過程中的吸收光譜

將緩沖液從 pH極端酸性或堿性逐漸調回中性,PC-645吸收光譜的變化情況如圖 4。結果顯示,PC-645在pH為3時盡管吸收強度下降, 但吸收峰形依然保持完整。將pH從3調整到7后, 吸收峰形并無改變(圖 4B), 但是強度明顯增加, 可以達到極高的復性效率。當pH降低到2后, 盡管復性后的吸收峰形可有一定程度的恢復(圖 4A), 但強度增加有限,并且出現了675～700 nm的一個長波吸收。說明pH為 3時, PC-645的大部分蛋白構象變化和色基狀態(tài)改變依然是可逆的, 在酸性區(qū)可逆變性和不可逆變性的臨界點可以達到 3以下, 低于其他藻膽蛋白類型[5]。而在堿性范圍內, 從 pH11或者 pH12恢復到pH7時, PC-645吸收峰的形狀略有恢復, 但強度沒有明顯的恢復(圖4C、圖4D)。表明在極端堿性pH條件下, 僅有局部的蛋白會發(fā)生復性, 絕大部分蛋白的變性劇烈, 基本是不可逆的。

3 尿素光譜動力學

3.1 尿素與pH變性比較

通常認為, 高質量濃度的尿素可使蛋白質達到完全變性[15]。如圖5所示, 當用pH為12的堿性尿素變性時, 其效果與單純使用堿性溶液時結果相似,在 580～650 nm范圍的吸收大幅下降, 645、625和582 nm吸收峰合并為一個590～600 nm的吸收單峰,而350～400 nm屬于色基的吸收明顯增加, 并且280 nm芳香族氨基酸的吸收增加。但使用pH2的酸性尿素變性時, 發(fā)現藻藍蛋白變性程度反而不及單純的酸性條件時劇烈, 這可能因為尿素氨基的質子化消耗了部分氫質子, 延緩了pH降低的效應。在含8mol/L尿素、pH為7的中性條件下, PC-645在10 min內即可完全變性, 且變性的結果與堿變性所得的圖譜更為近似。因此, 可見光區(qū)吸收值降低, 特征吸收峰形單峰化, 以及近紫外區(qū)色基吸收明顯增加等光譜特征, 可以看作是藻藍蛋白完全變性, 亞基構象破壞的標志。

圖4 pH復性過程中PC-645的吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of PC-645 in protein refolding induced by pH adjustment

圖5 尿素(8mol/L)在不同pH條件下對PC-645吸收光譜的影響Fig.5 Influence of urea (8mol/L)on the absorption spectra of PC-645 at different pH

3.2 PC-645的尿素復性過程中的吸收光譜

以往有報道, 尿素導致的蛋白質變性的動力學過程呈現S型, 質量濃度高于4 mol/L時, 蛋白變性速度極快[16], 因此實驗選擇 3 mol/L尿素處理PC-645并觀測其變性過程的光譜變化。結果如圖6。

PC-645在尿素中變性的結果, 只是導致 582、625和645 nm特征吸收峰值下降和350～400 nm色基的吸收的小幅度增加, 但峰形基本不變, 即使變性時間長達24 h, 也只有645 nm峰降低相對略快(圖6A)。說明低質量濃度尿素最初影響的只是PC-645的外部結構, 或者亞基的聚合狀態(tài), 而色基所處的內部蛋白環(huán)境沒有被波及, 表現出一定的耐受性。透析除去尿素時, PC-645在最初復性的1h內, 特征吸收峰吸收值逐漸增加, 峰形更為完整, 說明藻藍蛋白活性可逐漸恢復。但時間更長以后, 由于透析袋內藻藍蛋白樣品被稀釋, 表觀吸收值反而下降。

4 討論

PC-645作為一種捕光色素蛋白, 其最重要的生理功能就是吸收和傳遞光能。光能的吸收由 PXB、PCB和MBV三種藻膽素色基共同承擔, 它們在可見光區(qū)和紫外區(qū)都呈現特征的吸收, 當色基所處的蛋白質微環(huán)境不同或者發(fā)生變化時, 相同的色基也可產生不同的吸收譜峰。因此吸收光譜的變化是色基所處蛋白質內環(huán)境變化的探針, 直接反映亞基二、三級空間結構狀態(tài)。此外, PC-645色基吸收的能量是次第傳遞的, PXB、PCB和MBV任何一種色基激發(fā)后,PC-645在缺少能量受體的情況下都可發(fā)射并且只發(fā)射來自MBV的660～662nm特征熒光(圖3), 說明在PC-645中PXB和PCB都是敏化基團, 只有MBV是發(fā)色基團, 此熒光強度的變化直接反應能量傳遞效率的高低。由于這些色基分別位于不同亞基上, 要保證能量傳遞功能的實現, 要求蛋白質亞基要具備完整的二、三級甚至四級結構。因此, 改變環(huán)境條件,綜合觀測藻藍蛋白吸收和熒光光譜, 可給出大量的結構與功能信息。

圖6 PC-645在3mol/L尿素中的變性和復性過程吸收譜Fig.6 Absorption spectra of PC-645 in 3mol/L urea during denaturation and renaturation

如圖7所示, pH誘導的PC-645蛋白構象與功能變化可分為三個不同的區(qū)段。(1)穩(wěn)定區(qū): 在pH 3.5～7區(qū)域, 吸收和熒光譜都比較穩(wěn)定, 顯示蛋白質構象和功能在此區(qū)域都保持正常。(2)次穩(wěn)定區(qū): 在pH在7～10時, 熒光強度緩步下降, 但光吸收依然保持平穩(wěn), 說明位于亞基內部的色素基團的狀態(tài)、所處的疏水微環(huán)境都沒有改變, 二、三級結構大部分完好; 熒光傳遞效率的降低, 可能是亞基局部區(qū)域構象變化或者色素基團間的空間距離變化(如四級結構微擾)引起。(3)不穩(wěn)定區(qū): pH在 2.75～3.5和 pH為 10～11時, 吸光度和熒光強度都呈快速下降, 色基在近紫外和可見光區(qū)的吸收峰位變動, 蛋白構象處于快速崩潰期。

圖7 pH對PC-645吸收光譜、熒光光譜的影響Fig.7 Influence of pH on the traces of peak intensities of absorbance and fluorescence of PC-645

光譜分析結果說明, 藍隱藻PC-645在酸性范圍比在堿性范圍內更穩(wěn)定, 這一點在pH復性實驗中再次得到證實(圖4)。這可能與隱藻藻膽蛋白所處的生理環(huán)境特殊有關。藍藻藻膽蛋白附著在類囊體膜的表面與光合系統 II相連接, 紅藻藻膽蛋白附著在類囊體膜的外表面, 與葉綠體基質相接觸, 而隱藻藻膽蛋白處于類囊體腔中。伴隨著光合作用的進行, 光驅動電子傳遞的結果, 使葉綠體基質pH升高, 而類囊體腔則逐步酸化, 所以對于隱藻藻膽蛋白而言,在酸性條件下維持結構和功能的穩(wěn)定具有更為重要的生理意義。

隱藻PC-645在很寬的pH范圍以及一定質量濃度的尿素中均保持穩(wěn)定, 表現出構象與功能對環(huán)境變化的高度適應性。推測其亞基間可能存在一些關鍵位點, 在受到一定程度的pH環(huán)境干擾時, 這些位點能夠比較穩(wěn)定的維持蛋白的結構狀態(tài); 而在蛋白結構的一些非關鍵區(qū)域中, 肽鏈的結構則允許呈現一定的柔性變化而不影響功能的發(fā)揮[17]。隱藻PC-645的兩種 α亞基均含有大量的堿性氨基酸, 其中α1亞基等電點大于 9[18], 說明這些堿性殘基大多位于蛋白質表面; 而PC-645的β亞基PI為5.7～6.0,偏于酸性。顯然在隱藻PC-645兩種亞基聚合或四級結構形成中, 除了疏水力之外, 靜電相互作用可能扮演著重要角色。pH變化可影響氨基酸殘基的解離,從而影響如鹽鍵等靜電相互作用而導致蛋白質變性;而尿素則既可作為質子受體也可作為質子供體, 通過形成氫鍵使蛋白質肽鏈伸展[15]。PC-645能在廣泛pH條件下保持能量傳遞功能穩(wěn)定, 并且在低質量濃度尿素中維持吸收狀態(tài)較長時間不變, 說明其亞基結構相當致密, 并且四級結構穩(wěn)定。由于PC-645在酸性區(qū)變性的臨界pH在3～3.5附近, 接近羧基側鏈的解離區(qū)段, 推測酸性 β亞基上的羧基側鏈可能參與了亞基之間的關鍵作用, 當環(huán)境 pH低于羧基的pK值時, 大部分羧基質子化而失去負電荷, 導致蛋白空間結構崩潰、解體。

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