分子模擬技術在脂肪酶性質及催化機理研究中的應用進展

王 哲，王 普，黃 金

（浙江工業大學生物制藥研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一種甘油酯水解酶，屬α/β折疊水解酶類。它廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中。脂肪酶不僅可在油水兩相界面催化天然底物甘油酯的水解，還可在疏水介質中催化酯化、轉酯化、酯交換等反應。由于脂肪酶具有反應活性高、立體選擇性強和穩定性好等優點，使其在食品、皮革、造紙、有機合成、油脂化工、洗滌劑、化妝品、醫藥以及生物柴油合成等諸多領域具有廣泛應用。近年來，有關脂肪酶催化機理研究已逐漸引起人們的關注。脂肪酶有別于酯酶、蛋白酶等其它α/β折疊水解酶的最顯著特征在于它的催化活性中心部位被一個或多個α-螺旋片段遮蓋（稱為“蓋子”結構）。這種特殊結構使得當環境中存在油水兩相界面時，蓋子結構打開，從而暴露出脂肪酶催化活性中心，發揮其催化功能（在行使催化功能時，脂肪酶的催化活性中心三元組中的組氨酸（His）從絲氨酸（Ser）上吸收一個質子，使得Ser親核攻擊羰基上的碳原子，形成特殊的脂肪酶-底物復合物的四面體過渡態 TS（tetrahedral transition state）（見圖1）。在整個過程中天冬氨酸（Asp）通過與組氨酸（His）形成氫鍵起到穩定組氨酸位置的作用）。

隨著計算機技術、生物信息學和結構生物學等研究領域的快速發展，利用分子模擬技術研究脂肪酶的結構特點，在催化過程中的動態結構變化進而理解其反應機理和構效關系，最終實現對脂肪酶的理性設計與改造已引起眾多學者濃厚的研究興趣[1-2]。分子模擬技術的發展進程大致可分為3個階段：早期的皮秒（ps）級別的分子動力學模擬；柔性的分子對接技術；運算時間更長的分子動力學模擬以及 QM/MM（quantum mechanics/molecular mechanics，量子力學/分子力學）。

1 早期的分子動力學模擬

分子動力學模擬技術[3]主要依靠牛頓力學來模擬分子體系的運動，從而獲得生物大分子在已知最低能量構象附近一系列合理的空間構象。因此，早期關于脂肪酶分子動力學模擬技術主要是用于脂肪酶構象變化的研究。Norin等[4]于1994年通過分子動力學方法比較了米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor mieheilipase，RmL）在真空、水溶液和非極性溶液等不同溶劑條件下的構象變化，發現RmL 在非極性有機溶劑中比水相中的剛性更強，并且依據在乙酸乙酯溶劑中的動力學模擬，揭示出RmL 蓋子結構的關閉與打開狀態。Peters等[5]1996年研究多種溶劑對RmL結構的影響時也得出類似的結論。Zuegg等[6]于1997年運用分子動力學模擬方法研究了褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase，CrL）和洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，PcL）兩種脂肪酶催化水解伯醇酯和仲醇酯的四面體過渡態構象差異，提出了“大小口袋”規則（見圖2），并依據該規則揭示了脂肪酶催化上述兩種酯水解的對映體選擇性機理。由于受到當時計算機的運算速度所限，整個分子動力學模擬過程僅運行了15 ps。

2 柔性分子對接技術預測脂肪酶的對映體選擇性及催化機理

分子對接技術是通過幾何匹配、能量匹配和化學環境匹配來尋找復合物的最優狀態[7]。各種分子對接方法的計算體系均存在不同程度的簡化。根據簡化的程度和方式不同，可將分子對接方法分為剛性對接、半柔性對接和全柔性對接，其中，剛性對接主要用于蛋白-蛋白對接。隨著分子對接技術的發展，人們開始運用半柔性或全柔性的對接技術研究脂肪酶對底物的對映體選擇性。Tafi等[8]將全柔性對接技術應用于定性預測脂肪酶水解反應的對映體選擇性研究，通過分子對接打分以及復合物的幾何構象是否符合脂肪酶過渡態構象來判斷立體選擇性的優劣（見圖3）。

柔性分子對接技術具有快速預測脂肪酶在催化過程中的立體選擇性的優點，因此被廣泛應用于脂肪酶對底物選擇性的高通量虛擬篩選[9-13]。Tyagi等[9]通過對分子對接打分，預測了6種脂肪酶水解12種底物的能力（見表1），但由于僅依據對接打分來進行預測，其評價體系過于單一且導致預測結果并不理想，需要進一步結合復合物幾何構象等因素綜合判斷對接結果。Xu等[10]通過設計南極假絲酵母脂肪酶（Candida antarcticalipase B，CaLB）催化底物四面體過渡態的幾何構象來定性預測該脂肪酶對底物的對映體選擇性。經驗證，233個化合物中有 223個化合物被正確識別，預測準確率高達95.7%。分子對接技術作為一種簡單快速的計算機模擬手段應用于定性預測脂肪酶催化立體選擇性的研究已有較多報道，但其計算精確度不高，不能全面地闡述脂肪酶的催化機理。因此分子對接方法多被用于模擬初始的復合物構象，再結合運用其它手段，如定量構效關系（QSAR）、分子動力學和QM/MM 等方法，進一步研究其催化機理。

3 長運算時間的分子動力學模擬、QM/MM 方法及QSAR方法

隨著計算機運算能力的發展，分子動力學方法由最初只能計算皮秒（ps）級別的分子運動，逐漸發展到納秒（ns）級、甚至是微秒（μs）級。在此期間，人們利用分子動力學方法研究脂肪酶性質及催化機理的報道逐漸增多，且預測結果也越來越精準。

表1 6種脂肪酶水解12種底物的對接打分

已報道的將分子動力學應用于脂肪酶性質和機理研究涉及以下4個方面。①在不同溶劑中的脂肪酶構象變化。Rahman等[14]研究洋蔥伯克氏細菌脂肪酶（Burkholderiacepacialipase）在水-辛烷兩相混合溶劑體系中構象變化時發現，在水環境中脂肪酶的“蓋子”結構處于閉合狀態，而當辛烷分子接近“蓋子”時，脂肪酶的“蓋子”結構打開，且“蓋子”打開的幅度與溫度有關，溫度越高，打開幅度越大。Wedberg等[15]采用分子動力學方法考察了 5種水-有機溶劑混合體系對南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）氨基酸殘基柔性的影響，得到了類似的結論。②不同 pH 值條件下的酶結構變化。James等[16]將褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase）分別置于pH值為5.6和7.2的水溶液中，并進行了2 ns的分子動力學模擬，結果表明：中性pH值條件下脂肪酶“蓋子”區的柔性更強，底物更容易進入活性中心區域，因而反應速率更快。③研究脂肪酶與底物間的作用機制和選擇性機理[17-20]。Raza等[18]基于分子動力學方法，并通過計算南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）與底物形成四面體過渡態后的結合自由能，較好地預測了其對映體選擇性。Xu等[19]在研究南極假絲酵母脂肪酶 B與底物的過渡態相互作用過程中發現了幾種非常規的復合物結合模式（見圖4）。④對脂肪酶的結構進行理性的設計和改造[1，21]。Park等[1]基于分子動力學方法比較了南極假絲酵母脂肪酶B經定點突變前后在有機溶劑中的穩定性，并找到了該脂肪酶中3個可以提高其在有機溶劑中穩定性的關鍵殘基。

對于脂肪酶催化反應來說，首先脂肪酶通過“界面激活”效應打開蓋子結構，暴露出催化活性位點，隨后底物進入活性區域，與脂肪酶形成四面體過渡態，進而完成催化反應。分子動力學模擬雖然是通過大量的原子運動來優化整個體系，但并沒有考慮時間維度，而是把大量動力學模擬產生的構象進行統計，得到合理的平均構象。因而，它無法描述化學鍵的形成與斷裂。

要研究脂肪酶過渡態的成鍵過程，必須使用量子力學的方法，但由于運算量受到限制，人們尚無法對整個體系進行量子力學計算。為解決這一難題，Warshel等[22]于 1974年首次提出了量子力學/分子力學（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）方法，該方法將整個催化體系分為兩部分，即精確的量子力學（quantum mechanics，QM）部分和快速的分子力學（molecular mechanics，MM）部分（見圖5），采用局部的量子力學研究酶與底物的成鍵問題，其它理論研究則使用分子力學方法。使用QM/MM方法在一定程度上回避了量子力學計算量過大的問題。眾多研究者運用QM/MM方法針對多種脂肪酶的催化機理開展了更加深入的研究[2，23-26]（見表 2）。

值得關注的是，近年來人們基于另一種分子模擬方法，即定量構效關系（quantitative structure activity relationships，QSAR）來精確預測脂肪酶的對映體選擇性，且預測值與理論值的相關性非常理想（R2＞ 0.9）[27-28]。QSAR，是運用書寫模型來描述分子結構與分子某種生物活性之間的關系。基本假設是化合物的結構包含了其物理、化學以及生物信息，進而決定了該化合物的性質。該方法通過對少量底物的某種生物活性的實際測定，便可直接預測其它同系物的活性。這種方法雖然預測的準確率高，但僅對同系物有效，其適用性不強。

4 存在問題與展望

綜上所述，分子對接技術具有快速得到脂肪酶與底物復合物的優勢，被廣泛應用于高通量預測脂肪酶對底物的選擇性研究，計算簡單，但準確性較差。而分子動力學方法更接近于真實環境，準確度較高，但其采用的點電荷模型具有不可極化現象和計算過程中無法形成或斷開共價鍵等缺點。QM/MM方法通過局部的量子力學計算，解決了分子動力學方法無法成鍵的問題，在脂肪酶催化機理研究方面顯示出較大優勢。目前分子動力學和QM/MM方法仍然存在運算速度慢、預測精確度較差的問題。而QSAR方法雖然預測精確度高，但僅局限于同系物。

表2 QM/MM的方法研究脂肪酶催化機理

隨著計算機技術的發展，分子模擬技術在酶的性質及催化機理研究方面的應用將越來越廣泛。單一模擬方法已無法滿足研究的需要，聯合運用多種模擬手段已成為現今研究的主流。當計算機的運算能力逐步提升到不再成為制約模擬方法的關鍵因素時，根據從頭計算的分子動力學方法預測脂肪酶的空間結構、全量子力學研究脂肪酶的催化機理以及新的更加精確的力場，如可極化力場下的分子動力學等將更精確、更接近于真實環境，分子模擬技術將發揮出更加重要的作用。

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