生物燃料電池酶電極的研究進展

侯秀璋，馬曉燕，惠昱晨，常 海

（1西北工業大學空間應用物理與化學教育部重點實驗室，陜西省高分子科學與技術重點實驗室，陜西 西安710129；2西安近代化學研究所，陜西 西安 710065）

酶生物燃料電池是直接利用酶進行催化燃料氧化，將生物質化學能轉化為電能的一種裝置，是一種真正意義上的能量轉化率高、生物相容性好、工作環境溫和、原料可再生的綠色能源，并有望應用在疾病診療、環境保護以及航空航天等領域。但酶生物燃料電池由于使用壽命短、功率密度低或輸出電流小等缺點，目前還處于理論研究階段，尚未實現大規模的商業化應用。酶生物燃料電池的效率與酶電極的結構直接相關，其中起決定作用的包括氧化還原酶的特性、電池中電子傳遞方式以及酶在電極上的固定等因素。本文主要對目前文獻報道的生物燃料電池酶電極中氧化還原酶的種類、影響電子傳遞的因素以及酶的固定化等方面的研究進展進行了分析歸納，并提出了今后的發展趨勢。

1 氧化還原酶

在酶生物燃料電池中，酶可以溶解在底物燃料中或是固定在電極上，由于酶在電極上固定可以減少酶的流失提高催化效率，并且受外環境影響小，因此具有更廣泛的應用。圖1是一個單極室葡萄糖-O2生物燃料電池。中介體吡咯并喹啉（PPQ）修飾的葡萄糖氧化酶（GOx）電極作為電池的陽極，固定馬來酰亞胺（COx）修飾的細胞色素氧化酶（Cytc）作為陰極。電池工作時，GOx的輔酶因子FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）穿過酶外殼擴散出來，與固定在電極上的中介體以共價鍵合的方式結合，使葡萄糖最終轉化為葡萄糖酸，產生的電子通過中介體傳遞到電極上，H+擴散到陰極；在陰極區，O2從電極上得到電子，在COx修飾的Cytc的作用下與H+反應，生成H2O。

在早期研究中，大多數生物燃料電池只是在陽極使用生物氧化酶，而陰極與一般的燃料電池一樣是以氧氣作為氧化劑，這種生物燃料電池至今仍在研究中。近年來的研究發現，在陰極使用還原酶構筑生物燃料電池可以提高電池的功率密度，因此這也成為該領域的研究熱點。

1.1 陽極氧化酶

圖1 酶生物燃料電池基本原理圖[1]

陽極氧化酶的作用是催化氧化生物質，并能將釋放的電子有效的傳遞給電極，保證電池具有較高的輸出功率。酶的組成與結構不同，其催化轉化效率不同，可催化的底物燃料也不同。常見的陽極氧化酶有葡萄糖氧化酶（GOx）、纖維二糖脫氫酶（CDH）、果糖脫氫酶（FDH）等。

葡萄糖氧化酶是一種包含黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶因子且具有生物催化活性和生物化學穩定性的氧化還原酶[2-3]。由于葡萄糖氧化酶的輔酶因子深埋在酶蛋白質中，阻礙了其與電極之間的直接電子傳遞，因此許多研究者采用不同的納米材料、導電聚合物等實現直接電子傳遞的目的[4-5]。

纖維二糖脫氫酶也可以將葡萄糖作為底物，能夠在生物燃料電池中實現直接電子傳遞而引起了廣泛關注[6-9]。纖維二糖脫氫酶包含FAD和亞鐵血紅素，其中FAD催化底物氧化，同時亞鐵血紅素與電極材料之間形成電耦合作用[10]。Feifel等[11]以二氧化硅納米顆粒為基體，將纖維二糖脫氫酶固定在超分子結構體系中制備生物電極，產生的電流密度高于纖維二糖脫氫酶自組裝形成的納米生物分子層電極，兩種結構的酶電極均可完成電子的直接和間接傳遞。

纖維二糖脫氫酶對葡萄糖的催化效率比葡萄糖氧化酶低，理論上纖維二糖脫氫酶的底物應該是纖維二糖，但其對乳糖也具有很高的催化氧化效率。

果糖脫氫酶可以催化氧化果糖構筑生物燃料電池。果糖脫氫酶的固定化與纖維二糖脫氫酶類似，果糖脫氫酶攜帶一個FAD和一個亞鐵血紅素c，可為電極提供直接電子傳遞的電池模式[12]。

除了上述幾種包含輔酶因子的陽極氧化酶外，還有以乙醇脫氫酶（ADH）催化氧化發酵乙醇實現直接電子傳遞的生物燃料電池[13-14]。

1.2 陰極還原酶

在陰極添加還原酶，可以更高效地催化陰極的還原反應，提高電池輸出功率?；诖?，科學家們探索并發展了多種陰極還原酶，成為酶生物燃料電池領域一個新的發展方向。

藍多銅氧化酶類（BMCOs）家族中包含多種氧化還原酶，主要有漆酶（Lc）、膽紅素氧化酶（BOx）、抗壞血酸鹽氧化酶（AOx）、血漿銅藍蛋白（Cp）。其中漆酶和膽紅素酶是研究較多的陰極還原酶，氧化還原電勢高，可實現生物燃料電池中的直接電子傳遞。

漆酶在稀酸介質中（pH值為 4～5）通常會顯示很高的活性，但是在有氯離子存在下其活性會受到抑制。Javier等[15]將漆酶分子與4-[2-氨乙基]苯甲酸鹽（AEBA）功能化的石墨陰極表面以定向共價耦合的方式連接實現了直接電子傳遞，Zn作為電池陽極，制備了 Zn-AEBA漆酶電極，其電流密度達2977 μA/cm2，開路電壓為0.41 V時，功率密度達1190 μW/cm2。Thorum 等[16]以蒽-2-甲硫醇（AMT）改性金電極的表面，研究漆酶在該電極上的催化活性，發現蒽-2-甲硫醇可有利于漆酶的吸附，漆酶催化O2還原的最高開路電壓可達1.13 V。

膽紅素氧化酶由于能夠進行直接電子傳遞，并長期保持電極催化的穩定性而備受關注。Murata等[17]研究了膽紅素氧化酶與納米金粒子電極之間的直接電子傳遞，結果表明，膽紅素氧化酶修飾納米金粒子電極的電流密度高達5.2 mA/cm2，同時在保持48 h的連續測量后，電流密度仍然是初始值的90%。此外該作者還構筑了果糖/O2的直接電子傳遞生物燃料電池，以炭布作電池電極的基板，在 360 mV的靜態工作條件下，最大的電流密度和最大的功率密度分別為2.6 mA和0.66 mW/cm2；而在300 mV的攪拌條件下，最大電流密度和最大功率密度提高到4.9 mA和0.87 mW/cm2。這表明膽紅素氧化酶在提高生物燃料電池性能方面具有明顯的優勢。

藍多銅氧化酶類的結構如圖2所示，大多數藍多銅氧化酶的催化部位包括4個銅原子：在T1部位（Cu-T1）可從底物中獲得電子，可將電子直接轉移到電極上；T2/T3為銅電子簇（Cu-T23），此處使O2還原成水。一些藍多銅氧化酶還具有更復雜的結構，如人工合成的血漿銅藍蛋白包含 6個 Cu離子、3個Cu-T1和3個Cu-T23[如圖2(c)]。藍多銅氧化酶類修飾的陰極催化效率高，電流密度可達毫安級（mA/cm2），但是催化效率受到O2在電極表面的擴散的限制[17-18]。H2O2可代替 O2作陰極的氧化劑被催化還原。

圖2 藍多銅氧化酶的晶體結構[19]

辣根過氧化物酶（HRP）和微過氧化物酶-11（MP-11）在不同的改性電極表面固定，酶在改性后的電極上能夠保持其生物活性以及原始結構，并且電極顯示出較高的電子傳遞效率，可以作為直接電子傳遞的生物陰極[20-23]。

2 電子介體電極

由于酶的活性中心常常被深埋在蛋白質的多肽鏈中不利于電子的傳遞，使得氧化還原中心到電極表面的電子傳遞不易被檢測。因此，需要氧化還原中介體的存在以驅動生物電催化過程，提高酶電極之間的電子傳遞效率，如圖3(b)所示，中介體在酶與電極之間起傳遞電子的作用。中介體可以分散在溶液中，也可以采用復合膜包覆，或與酶一起在基體材料中固定等形式存在。

常用的小分子中介體包括：二茂鐵及其衍生物、亞甲基藍、醌類、亞鐵氰化物以及帶有包括鄰二氮雜菲衍生物（PDs）一類的無機配體金屬復合物[24-28]等。而黃素、奎寧這樣的生物小分子可以將電子直接轉移到電極上。Li等[29]以合成的聚-2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿-co-p-乙烯基苯硼酸-co-乙烯基二茂鐵（PMVF）為電子傳遞介質，GOx作為酶催化劑，在溫和條件下，使聚乙烯醇（PVA）鏈與GOx相連。在苯硼酸和羥基之間通過選擇性反應，使PMVF與PVA兩種聚合物立即形成凝膠。采用旋轉涂布技術，在金電極表面上構筑PMVF/GOx-PVA重復的多層結構。GOx對葡萄糖氧化產生的電流可達0.38 V（vs. Ag/AgCl），且電流隨著PMVF/GOx-PVA層數的增加而增加，在凝膠中實現了分子在每一層和自由分散的基質的表面間的電子轉移，可作為研究生物電子設備的有效方法。

圖3 兩種電子傳遞方式[1]

一些氧化還原聚合物也可以作為電子中介體，改變電極電位，提高電流密度。Zafar等[30]發現葡萄糖脫氫酶/鋨氧化還原聚合物（FADGDHs/Ospolymer-basd），如圖4，電極對于葡萄糖基體具有高電流密度、高靈敏度和較寬的線性范圍。同時酶經過去糖基化后體積縮小，有效地提高了酶和電極之間的電接觸點范圍，進而提高了電子傳遞效率和電流密度。

圖4 鋨-聚[鋨(4,4′-二甲基-2,2′-聯吡啶) 2(聚乙烯異丁醚)10氯] +的結構[30]

3 直接電子傳遞電極

雖然中介體提供了電子傳遞的有效途徑，但是由于部分中介體具有毒性，會使酶失活，而采用直接電子傳遞方式可以緩解這一問題。直接電子傳遞是指酶的活性中心催化底物燃料氧化，電子從底物分子直接傳遞到電極上[圖3(a)]，因此成為構筑新型生物燃料電池、傳感器的理想方式。

目前，導電聚合物（如聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺等）、碳納米管（CNTs）、納米纖維、納米粒子（NPs）、有序的介孔硅材料和有機客體分子等常被用來構筑直接電子傳遞電極。導電聚合物以其特殊的導電性、機械強度、耐腐蝕等性能，在酶固定化方面得以研究，以提高直接電子傳遞效率。Homma等[31]將酸性磷酸酶（ACP）以共價鍵合的方法固定在聚苯胺/聚丙烯酸復合膜（PANI/PAA）上，復合膜電沉積到金電極上，作為生物燃料電池的陽極。該電極的最大輸出功率為 6.0 μW/cm2，是無PANI/PAA復合膜時的70倍。

碳納米管、納米粒子（NPs）、納米纖維、介孔材料因其具有獨特的表面效應可提高載酶量及電極穩定性，且質輕、多孔等特性，可促進直接電子傳遞效率，用以制備具有納米結構特征的酶電極，構筑生物燃料電池。Yabuki等[32]將含有納米纖維素的離子液體涂布在電極表面，再使電極沉浸在蒸餾水中以除去離子液體，此時膜上的酶依然可以保持活性，穩定性測試結果表明，該酶電極可在6個月內對葡萄糖進行檢測。

也有研究者認為直接電子傳遞與摻雜在碳納米管中的金屬粒子有關，由于雜質金屬與酶的協同作用使底物燃料氧化得更徹底，從而進一步提高了酶電極的直接電子傳遞效率[33]。

酶與電極之間的直接電子傳遞的優化對于提高生物燃料電池催化效率是至關重要的，而轉基因技術為這一目標的實現提供了新的發展思路。Holland等[34]利用基因修飾技術對葡萄糖氧化酶進行了修飾，使其在活性點附近帶有一個自由的硫醇基，有利于馬來酰亞胺修飾的納米金粒子在酶上特定位置的負載。將納米金粒子修飾的酶固定到電極上，實現了酶-電極之間的直接電子傳遞，顯示出轉基因技術在基于直接電子傳遞的第三代生物燃料電池中的潛在應用。

與此同時，去糖基化的葡萄糖氧化酶[35-36]可以縮短酶的氧化還原中心與電極表面的距離，提高直接電子傳遞效率。其它氧化還原酶也可以嘗試去糖基化的方法，縮減酶的尺寸從而改善酶與電極表面的電子傳遞途徑，提高電流密度。

4 酶的固定化

早期燃料電池是將酶溶于溶液中，由于酶在溶液中只能保持數天，所以電池的壽命很短，而將酶固定在電極上可以保持酶的活性，延長電池的使用周期。酶的固定化方法主要包括吸附、交聯、共價鍵合、脫輔酶的重構以及聚合物等材料的包覆。

物理吸附是最簡單的酶固定化方法，酶蛋白的活性中心不易被破壞，但相互作用較弱，需進一步提高載酶量及酶的穩定性。研究不同CDHs的直接電子傳遞能力，將CDHs吸附于石墨電極或單壁碳納米管（SWCNTs）上，發現SWCNTs能夠增加電催化電流[37]。

包覆是將酶限制在聚合物基體、溶膠-凝膠以及氧化還原水凝膠中，或者是將酶包裹在半滲透膜中，不僅可以使酶自由移動，同時還可以阻止酶和小分子介體的流失。Latonen等[38]采用摻雜磺化聚苯乙烯（PSS?）且具有二層有序結構的聚(3,4-亞乙二氧基噻吩)（PEDOT）包覆毛栓菌漆酶（ThL）制備在陰極催化 O2還原的酶電極，致密的 PEDOT-PSS?復合膜可防止ThL流失提高載酶量，并可實現ThL與電極間的直接電子傳遞，當選擇 pH=4.5時，該電極的穩定性最佳。

由于酶及固定化材料具有不同的功能化基團，通過共價鍵合的方法可使酶直接固定在金屬及納米材料的表面。交聯的方法使酶形成三維網狀的聚合物，但同時降低了酶的穩定性及活性。目前研究較多的是采用共價鍵合與交聯相結合的方法制備自組裝復合膜。Aquino等[39]利用層層組裝技術（LBL）制備了乙醇/O2生物燃料電池。乙醇脫氫酶（ADH）和樹枝狀的聚酰亞胺利用LBL在碳紙上固定化，可更好地控制酶在電極上的沉積減少酶的消耗，產生的功率密度為0.12 mW/cm2。但是由于存在氣體分散層（GDL）以致其穩定性不佳。Salimi等[40]在玻碳電極上以多層組裝的方法構筑高穩定性的葡萄糖氧化酶電極，硫脲（TU）作共價鍵合的交聯劑，二茂鐵甲醇作電子傳遞介體，經測試葡萄糖固定化酶顯示優異的電催化活性，并且擁有4個雙分子層的TU/GOx穩定性良好，重現性高，酶可以在多層結構中保持活性，靈敏度達5.73 μA/(mmol·cm2)。

通過電化學還原將金電極、石墨電極、玻碳電極（GC）表面共價改性吸附芳基重氮鹽，然后將酶膜接枝到功能化的電極上，形成的電極膜穩定性好，輸出電壓高。Pellissier等[41]將葡萄糖氧化酶自組裝單層膜負載在功能化的玻碳電極的表面，該電極可在6個星期內保持酶的大部分活性。

另外，殼聚糖是一種天然高分子，因其具有良好的生物相容性以及血液相容性，且易進行一些化學修飾和改性（如酯化、烷基化、氧化、?；?、螯合等），可作為固載酶的基體材料。Yarman等[42]將微過氧化物酶-11固定在殼聚糖金納米粒子基體中，催化過氧化氫在陰極還原，發現微過氧化物酶-11在殼聚糖金納米粒子基體中分散性良好，可檢測苯醌在陰極的還原信號，相同的傳感器原理也可以用在芳香族藥物中。

5 總結與展望

近幾年，酶生物燃料電池的功率密度達到了 1 mW/cm2，使微型電子設備的成功應用成為可能。但是酶生物燃料電池需進一步提高功率密度和能量效率，選擇生物相容性好的天然酶、人工酶以及目前研究較多的酶基因修飾技術和去糖基化酶也可實現酶與電極間的直接電子傳遞，提高電流密度；同時小分子中介體、氧化還原聚合物中介體的研究也促進了酶電極的發展；此外采用導電聚合物、碳納米管等材料修飾電極需要保持材料性能的同時使酶具有更高的催化活性。而決定酶生物燃料電池性能的關鍵是酶電極的穩定性，在對催化活性位點保持連續的燃料供給的同時要確保酶與電極之間有效的電子傳遞，因此選擇合適的酶固定化方法至關重要。研究新方法和新材料來完善酶電極，最大程度上提高載酶量，如通過自組裝方法使酶固定在三維有序的復合膜結構中或在改性電極上負載酶膜等。

通過選擇高效的催化氧化還原酶以及合適的酶固定化方法，制備具有更高效率的酶電極，使酶生物燃料電池在醫用、環境保護等方面具有更廣闊的應用前景。綜上所述，隨著國內外對酶電極研究的不斷深入，電子傳遞方式及其影響因素、酶活性與耐久性的提高等會成為今后一段時間的研究重點。

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