多重耐藥菌中β－內(nèi)酰胺酶的基因型研究＊

陳定強(qiáng)，彭玉婷，羅毓婷，徐韞健，林勇平，楊 羚（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科 510120）

細(xì)菌產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌耐β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物最普遍的機(jī)制，β－內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因賦予細(xì)菌編碼對應(yīng)酶的能力［1］。由于β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的菌株也變得越來越常見，并在選擇和進(jìn)化壓力中產(chǎn)生多種不同的酶基因型［2］。這些基因還往往與其他耐藥相關(guān)基因（如喹諾酮類耐藥基因和磺胺類耐藥基因等）共同存在，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性［3］。本研究收集59株臨床分離的多重耐藥菌，通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測其攜帶的β－內(nèi)酰胺酶基因類型，分析β－內(nèi)酰胺酶基因在多重耐藥菌中的分布特征，為進(jìn)一步研究和控制細(xì)菌耐藥性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 研究菌株為2009～2010年廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分離的59株多重耐藥菌，包括29株大腸桿菌和30株肺炎克雷伯菌。其中分離自尿液標(biāo)本的32株，痰液標(biāo)本19株，血液標(biāo)本7株，膿液標(biāo)本1株。細(xì)菌鑒定與藥敏試驗的質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.2 儀器與試劑 VITEK2全自動微生物分析儀、細(xì)菌鑒定卡與藥敏卡為BioMerieux公司產(chǎn)品，PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品，核酸電泳儀與凝膠成像儀為BioRad公司產(chǎn)品。MH培養(yǎng)基和藥敏紙片由Oxoid公司提供。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合體系為Takara公司產(chǎn)品，DNA分子標(biāo)記物購自Tiangen公司，瓊脂糖購自Biowest公司。

1.3 細(xì)菌總DNA的提取 采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA。挑取平板上的一個單菌落，重懸于300μL雙蒸水中。置沸水浴中孵育10min后，13 500r／min離心5min，吸取上清液至新的微量離心管中，作為PCR反應(yīng)的DNA模板。

1.4 PCR引物 PCR引物序列見表1，所有引物由上海英濰捷基公司合成。

1.5 β－內(nèi)酰胺酶基因的檢測 按照文獻(xiàn)［4］報道的方法，用單重和多重PCR法對21種β－內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行，包括2×PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合體系10 μL，細(xì)菌總DNA模板1μL，PCR引物各1μL，并用雙蒸水補至20μL。PCR反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性2min，然后95℃變性30s，退火溫度見表1，時間為30s，72℃ 延伸1min，進(jìn)行35個循環(huán)，最后延伸7min。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳40min，溴化乙錠溶液染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 59株多重耐藥菌的藥敏結(jié)果 59株多重耐藥菌包括29株大腸埃希菌與30株肺炎克雷伯菌，對氨芐西林的耐藥率為100%，對頭孢他啶的耐藥率為91.5%，對慶大霉素的耐藥率為66.1%，對環(huán)丙沙星的耐藥率為72.9%，值得注意的是3.4%及1.7%的菌株分別對厄他培南和亞胺培南耐藥，顯示耐碳青霉烯類藥物菌株的出現(xiàn)。對其他抗菌藥物的耐藥情況見表2。

2.2 β－內(nèi)酰胺酶基因型分布 在21種β－內(nèi)酰胺酶基因型中，有10種在多重耐藥菌株中被檢出（表3）。陽性率最高的是TEM，為54.2%（32／59）；SHV 的陽性率為45.8%（27／59）；CTX－M－G1、G2和G9的檢出率分別為32.2%（19／59）、23.7%（14／59）和52.5%（31／59），說明CTX－M 型β－內(nèi)酰胺酶分布非常廣泛；另外，分別有4株和2株肺炎克雷伯菌檢出DHA和MOX基因，CMY、OXA－1和ACT基因則各有1株檢出。未檢到含GES、VEB、IMP、VIM、KPC、CTX－M－G8／25、ACC、FOX、PER、OXA－48等基因的菌株。

表1 PCR引物序列和反應(yīng)條件

2.3 多種β－內(nèi)酰胺酶基因型共存情況分析 見表4。59株多重耐藥菌中有67.8%（40／59）的菌株攜帶兩種以上的β－內(nèi)酰胺酶基因型，其中肺炎克雷伯菌攜帶兩種以上基因型菌株更為常見，達(dá)76.7%（23／30），值得注意的是，有2株肺炎克雷伯菌攜帶5種β－內(nèi)酰胺酶基因型。

表2 59株多重耐藥菌株的藥敏結(jié)果（%）

表3 59株多重耐藥菌中β－內(nèi)酰胺酶基因型分布情況（n）

表4 多種β－內(nèi)酰胺酶基因型共存的菌株數(shù)目（n）

3 討 論

大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是臨床感染常見的革蘭陰性菌，近年來由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，多重耐藥菌株的出現(xiàn)越來越普遍［5］。β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物是臨床治療細(xì)菌感染的最常用抗菌藥物，但β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和傳播令細(xì)菌對這類抗菌藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)［6］。本研究對59株多重耐藥的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結(jié)果分析顯示，這些菌株對多種青霉素類和頭孢菌素類藥物的耐藥性非常嚴(yán)重，而且出現(xiàn)了耐碳青霉烯類藥物的菌株。有文獻(xiàn)報道，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌往往可同時攜帶對其他種類抗菌藥物耐藥的基因，這些菌株易發(fā)展成多重耐藥菌，給臨床感染治療帶來很大的困難［7］。本研究中收集的59株多重耐藥菌對喹諾酮類和磺胺類藥物的耐藥率均較高，也證實了這一點。

對21種β－內(nèi)酰胺酶基因的檢測結(jié)果顯示，本研究收集的多重耐藥菌株攜帶其中10種。對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的檢出率分析顯示，大腸桿菌僅檢出4種β－內(nèi)酰胺酶基因，而肺炎克雷伯菌則檢出10種，由此顯示后者的β－內(nèi)酰胺酶基因型更具多樣性。多重耐藥的肺炎克雷伯菌可攜帶多種耐藥基因，且往往是定位在可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，可通過在腸桿菌科細(xì)菌間的接合作用引起這些基因的擴(kuò)散，進(jìn)一步加大了預(yù)防控制的難度［8］。雖然研究菌株中包含了耐碳青霉烯類藥物的菌株，但并未檢出VIM、IMP和KPC等碳青霉烯酶，說明這些菌株中碳青霉烯類藥物耐藥性可能與其他因素有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究以闡明其耐藥機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌中同時攜帶多種β－內(nèi)酰胺酶基因的情況十分普遍。不同的β－內(nèi)酰胺酶有不同的水解底物，對僅產(chǎn)一種β－內(nèi)酰胺酶基因的菌株來說，可以選擇其不能水解的β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物進(jìn)行治療。但多種基因型共存于同一菌株時，細(xì)菌往往對所有青霉素類和頭孢菌素類藥物都耐藥，大大增加了治療的難度。如何控制和治療這些菌株引起的感染，已經(jīng)成為臨床抗菌治療和醫(yī)院感染控制迫切需要解決的大問題。

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