電項針疏、密波對AD模型大鼠空間記憶能力及海馬區(qū)BDNF/TrkBmRNA的影響

周 圍，呂小笑，張 巍

(1．溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江溫州325001;2．永康市中醫(yī)院，浙江永康321300;3．云陽縣人民醫(yī)院，重慶404500)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以記憶減退、認(rèn)知功能障礙等為主癥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機制尚不明確。研究表明神經(jīng)元的凋亡可能是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的主要原因。TrkB是腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain－derived neurotrophic factor，BDNF)調(diào)節(jié)突觸活性與細(xì)胞分化進而影響大鼠海馬結(jié)構(gòu)和神經(jīng)行為的一個重要蛋白靶點［1］。BDNF與受體TrkB結(jié)合后對發(fā)育過程中神經(jīng)元的存活、分化以及成年神經(jīng)元的存活和功能發(fā)揮重要作用。本研究擬通過D－半乳糖聯(lián)合AlCl3制作AD模型大鼠，采用電項針疏、密波治療后觀察其行為學(xué)改變，以及BDNF及其TrkB受體的mRNA的影響，探討電項針疏、密波改善AD學(xué)習(xí)記憶能力的可能作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組

將40只雄性、健康 Sprague－Dawley(SD)大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心)，根據(jù)體重(320±50)g從小到大編號，從隨機數(shù)字表［2］中任意選取起始數(shù)求余數(shù)(除以組數(shù))，經(jīng)過調(diào)整后分為空白組、模型組、治療1組，治療2組，每組10只。

1．2 主要試劑及實驗儀器

AlCl3(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);D－半乳糖(上海陽光生物科技有限公司);BDNFmRNA、Trk-BmRNA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯示劑(北京中山生物技術(shù)有限公司)。德國萊卡2135型切片機;美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng);中國DM S－2型Morris水迷宮;DJ－6805D型脈沖電針儀。

1．3 造模方法

空白組僅給予正常飲食和飲水。模型組與治療組每天給予胃飼20 mg·ml－1的 AlCl3水溶液 2 ml，腹腔注射48 mg·kg－1的 D － 半乳糖，連續(xù)8 周［3］。

1．4 治療方法

常規(guī)消毒穴位與針具，取大鼠雙側(cè)“風(fēng)池”、“供血”，Φ0．40 mm ×25 mm 毫針直刺 10 mm，后接 DJ－6805D型脈沖電針儀，一組導(dǎo)線同側(cè)上下連接，“風(fēng)池”為正極，“供血”為負(fù)極。治療 1組即疏波組(2 Hz)，治療2組即密波組(50 Hz)。持續(xù)脈沖刺激20 min，每周6次，連續(xù)治療4周。空白組、模型組采取治療組同樣的抓取、綁定(20 min)，但不予治療。

1．5 行為學(xué)測試

各組大鼠分別于造模前、成模后5天和治療后5天進行Morris水迷宮行為學(xué)測試［4］。每次實驗歷時5天，每天上、下午各訓(xùn)練1次。記錄大鼠找到平臺所需要的時間，即逃避潛伏期。設(shè)定最長游動時限為60 s，如果大鼠60 s內(nèi)未能找到平臺，逃避潛伏期記為60 s，同時將其引至平臺上，在平臺上停留15 s。

1．6 陽性細(xì)胞表達(dá)分析

原位雜交檢測各組大鼠海馬BDNF/TrkBmRNA陽性表達(dá)，并采用美國motica3000顯微攝影成像，于400倍鏡下選取海馬CA1－CA3區(qū)攝影，每組選取10例照片，在Motic image 3．2圖像分析軟件下進行分析，計算陽性細(xì)胞數(shù)。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 水迷宮檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力潛伏期比較(ˉ±s，s)

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力潛伏期比較(ˉ±s，s)

注:與空白組比較，aP ＜0．05，bP ＜0．01;與模型組比較，cP ＜0.05，dP ＜0．01，與疏波組比較，eP ＜0．05。

組別n 逃避潛伏期(s)造模前 成模后第5天 治療后第5天空白組10 22．36 ±2．63 21．80 ±2．94 21．45 ±2．93模型組 10 21．40 ±2．59 44．70 ±2．31b 40．17 ±3．28b疏波組 10 20．90 ±2．67 44．80 ±2．62b 33．29 ±3．08bc密波組 10 21．44 ±2．71 45．50 ±2．72b 26．57 ±3．25ade

由表1統(tǒng)計結(jié)果可見，各組大鼠造模前，逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。成模后，與空白組比較其它組逃避潛伏期有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，表明造模成功。治療后，與空白組比較，密波組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，疏波組有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，疏波組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，密波組有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);與疏波組比較，密波組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

2．2 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkBmRNA陽性細(xì)胞表達(dá)

表2 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkBmRNA陽性細(xì)胞表達(dá)(ˉ±s個，400倍視野)

表2 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkBmRNA陽性細(xì)胞表達(dá)(ˉ±s個，400倍視野)

注:與空白組比較，aP ＜0．05，bP ＜0．01;與模型組比較，cP ＜0.05，dP ＜0．01，與疏波組比較，eP ＜0．05，fP ＜0．01。

組別 n BDNFmRNA陽性表達(dá) TrkBmRNA 陽性表達(dá)空白組10 45．81 ±4．16 39．38 ±3．02模型組 10 21．38 ±3．51b 25．75 ±1．85b疏波組 10 27．43 ±2．75bc 30．63 ±1．39bd密波組 10 32．50 ±4．19ade 37．88 ±1．28df

由表2統(tǒng)計結(jié)果可見，與空白組比較，密波組BDNF mRNA陽性細(xì)胞表達(dá)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)， 橫型組、疏波組BDNF/TrkBmRNA陽性細(xì)胞表達(dá)均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);與模型組比較，疏波組BDNF mRNA陽性表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，疏波組TrkB mRNA陽性表達(dá)與密波組BDNF/TrkB mRNA陽性細(xì)胞表達(dá)均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);與疏波組比較，密波組BDNF mRNA陽性表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，密波組TrkB mRNA陽性表達(dá)有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．01)。

3 討論

學(xué)習(xí)與記憶是認(rèn)知的基礎(chǔ)。近年研究表明，BDNF在學(xué)習(xí)記憶過程的多個方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用［5］。其作用發(fā)揮主要依賴與其特異性受體TrkB的結(jié)合，形成配體/受體復(fù)合物，再通過細(xì)胞質(zhì)途徑激活多種蛋白質(zhì)和酶［6］，使信號從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，最后引起 DNA、RNA表達(dá)的改變，完成蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮神經(jīng)元支持、營養(yǎng)、再生等生物學(xué)功能［7］。BDNF具有防止受損神經(jīng)元死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生及分化［8］、維持正常神經(jīng)元的生存，維持突觸可塑性［9］，從而達(dá)到改善AD模型大鼠空間記憶能力。

本實驗通過Morris水迷宮觀察D－半乳糖聯(lián)合AlCl3對AD模型大鼠記憶功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠潛伏期較空白組明顯延長，表明其學(xué)習(xí)記憶能力顯著減退。有研究表明該造模方法既能較好的模擬AD發(fā)生的漸進性衰老表現(xiàn)［10－11］，出現(xiàn)與自然衰老相似的代謝紊亂特征［12－13］，又能更接近 AD的病理特征［14］。經(jīng)過治療后，疏波組和密波組的潛伏期較模型組有很大改善(分別為P＜0．05和 P＜0．01)，表明電項針能夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而且密波組療效優(yōu)于疏波組。原位雜交檢測結(jié)果表明，疏波組與密波組的BDNF/TrkBmRNA陽性表達(dá)較模型組均有增加(P＜0．05和P＜0．01)，而且治療組之間具有差異性(P＜0．05)，提示密波療效優(yōu)于疏波療效。

［1］ Li XZ，Yan J，Huang SH，et al．Identification of a key motif that determines the differential surface levels of RET and TrkB tyrosine kinase receptors and controls depolarization enhanced RET surface insertion［J］．Biol Chem，2012，287(3):1932 －1945

［2］ 孫振球．醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)［M］．2版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:832

［3］ 汪澤棟，周圍，王淑慧，等．不同頻率電項針對AD模型大鼠空間記憶能力及海馬區(qū)pCREB1和BDNF的影響［J］．針灸臨床雜志，2013，29(1):66 －69

［4］ Morris R．Developments of a water－maze procedure for studying spatial learning in the rats［J］．J Neurosci Mehods，1984，11(1):47 － 60

［5］ Bekinschtein P，Cammarota M，Izquierdo L，et al．BDNF and memory formation and storage［J］．Neuroscientist，2008，14(2):147 － 156

［6］ Patapoutian A，Reichardt LF．Trk receptors:mediators of neurotrophin action［J］．Curr Opin Neurobiol，2001，11:272 －280

［7］ Marini AM，Jiang X，Wu X，et al．Role of brain － derived neurotrophic factor and NF－kappaB in neuronal plasticity and survival From genes to phenotype［J］．Restor Neurol Neurosci，2004，22(2):121 －130

［8］ Dunham JS，Deakin JF，Miyajima F，et al．Expression of hippocampal brain－derived neurotrophic factor and its receptors in Stanleyconsortiumbrains［J］．J Psychiatry research，2009，43(14):1175 － 1184

［9］ Vecsey CG，Hawk JD，Lattal KM，et al．Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP－dependent transcriptional activation［J］．Neurosci，2007，27(23):6128 －6140

［10］ 李文彬，韋豐，范明，等．D－半乳糖在小鼠上誘導(dǎo)的擬腦老化效應(yīng)［J］．中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1995，9(2):93 －95

［11］ 余資江，康朝勝，李宏偉．D－半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶行為改變對海馬神經(jīng)發(fā)生的影響［J］．中國老年學(xué)雜志，2009，29(7):1672－1673

［12］ 錢小明，吳振國，施志明，等．衰老小鼠組織牛磺酸含量與脂質(zhì)過氧化損傷的關(guān)系［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1995，15(5):390

［13］ Guo GW，Wu YL，Yang XH，et al．Effects of aluminum chloride on amyloid βprotein precursor and glial fibrillary acidic protein expression in rat cortex［J］．chin J Pharmacol Toxicol，1999，13(3)227 －30

［14］ 周原．兩種阿爾茨海默病大鼠模型比較的實驗研究［D］．延吉:延邊大學(xué)，2007