紅曲菌兩種熒光代謝產物與BSA相互作用的光譜法研究

黃志兵，許 楊，張淑云，李來生，李燕萍

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中德聯合研究院，江西南昌330047;2.南昌大學分析測試中心，江西南昌330047)

紅曲是我國的傳統發酵產品，在我國一直被認為具有藥用和食用雙重功效，不僅是祖國寶貴的科學文化遺產，而且在世界微生物史上具有重要意義。近年來，隨著對紅曲中生物活性物質研究不斷發展，各國學者對其進行深入而廣泛的研究，發現紅曲能產生許多令人矚目的次級代謝產物，如紅曲色素、膽固醇抑制劑、及具有降血壓、抗菌、降血氨、抗腫瘤、降血糖等生理活性成分［1］，使傳統紅曲增添新的內涵。一種天然物質能同時具有多項生物活性實屬罕見，因此研究紅曲菌新的代謝產物和開發紅曲新功能現已成為各國研究熱點之一。紅曲菌最主要代謝產物為紅曲色素，紅曲色素是一類聚酮類物質，屬于復合色素，主要包括紅、橙、黃色素三大類，各大類又分為很多組分。目前，已確定出化學結構的紅曲色素有6種，其中包括紅曲素(Monascin)和紅曲黃素(Ankanavin)兩種黃色素，紅斑紅曲素(Rubropunctatin)和紅曲玉紅素(Monascorabrin)兩種橙色素、紅斑紅曲胺(Monaseorubramine)和紅曲玉紅胺(Rubropunfamine)兩種紫紅色素，它們均屬Azaphilone類真菌代謝物。近年來，越來越多的紅曲菌新的Azaphilone類代謝產物及其抗癌生物活性被報道［2-5］。然而，有關紅曲菌Azaphilone類代謝產物與BSA相互作用的報道甚少。前期實驗從紅曲中分離純化出兩種熒光代謝產物，分別命名為monasfluore A(MFA)和 monasfluore B(MFB)［6-7］。采用光譜法研究兩種熒光代謝產物與BSA的相互作用下的熱動力學參數和作用力類型等，對進一步研究紅曲菌Azaphilone類代謝產物的生物活性機制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲菌兩種熒光代謝產物MFA和MFB 自制，純度大于95%［6-7］;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;NaH2PO4、Na2HPO4、CH3CH2OH 均為分析純;實驗用水均為超純水。

FS F-4500熒光分光光度計 日本日立公司;ULTRASPEC4300紫外分光光度計 美國Pharmacia公司。

1.2 實驗方法

將一定量的BSA和上述兩種紅曲菌熒光代謝產物分別加入到容量瓶(10mL)中，并用含50%乙醇的PBS緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)稀釋。準確移取一定量的上述溶液于石英熒光池(1cm)中，進行熒光光譜掃描。BSA的熒光激發和發射波長分別為280nm和343nm，發射波長掃描范圍400～600nm，狹縫寬度為5nm。紫外-可見吸收的參比液為含50%乙醇的 PBS 緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)，吸收波長掃描范圍為300～450nm。

分別在25、35、45℃溫度條件下，固定BSA濃度為3.03×10-6mol/L，加入一系列濃度的MFA或MFB后的BSA溶液進行熒光光譜掃描，記錄熒光強度，計算熒光淬滅常數，推導熒光淬滅機理。

圖1 MFA(A)和MFB(B)分別與BSA作用的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of MFA(A)and MFB(B)by BSA at different concentration

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

在含 50%乙醇的 PBS緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)條件下，測定了不同濃度的 BSA對MFA和MFB紫外吸收譜圖的影響，從圖1可看出，隨BSA濃度增大，MFA(A)和MFB(B)的最大吸光度值均增加，但MFB增加值比MFA更明顯，說明MFB較MFA更容易與BSA作用。

2.2 熒光光譜

紅曲菌兩種熒光代謝產物(MFA和MFB)的激發波長和發射波長分別為396和460nm［6-7］，對一系列含相同濃度的MFA和MFB與不同濃度BSA溶液混合后，靜置30min，然后分別記錄熒光光譜。由圖2(A)可知，隨加入的BSA溶液濃度增加，MFA的熒光強度幾乎沒有變化，可能原因是MFA與BSA之間的作用較弱;從圖2(B)可知，隨加入的BSA溶液濃度增加，MFB的熒光強度逐漸降低，說明MFB與BSA之間發生了明顯的作用。

圖2 MFA(A)和MFB(B)分別與BSA作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence quenched spectra of MFA(A)and MFB(B)by BSA at different concentration

然后固定BSA溶液的濃度，而改變MFA和MFB溶液的濃度，并進行熒光光譜掃描。由圖3可知，隨加入的MFA和MFB溶液濃度增加，BSA的熒光強度不斷降低。這說明了MFA和MFB與BSA之間可能存在使得BSA的熒光降低的相互作用。

2.3 熒光猝滅機理和作用力類型

熒光猝滅過程可分為靜態猝滅和動態猝滅［8］。若為動態猝滅，其作用過程遵循Stern-Volmer方程，F0/F=1+Kqτ0［Cmonas］=1+KSV［Cmonas］ 式(1)［9］

根據上述方程測定了不同溫度(25、35、45℃)時，加入MFA(圖未給出)或MFB后BSA熒光強度的變化，由實驗數據作出BSA的Stern-Volmer曲線

表1 在pH7.4條件下MFA和MFB與BSA作用的熱力學參數Table 1 Thermodynamic parmeters of monasfluoreA and monasfluoreB-BSA interaction at pH7.4

圖3 在25℃(A)，35℃(B)and 45℃(C)下MFB對BSA熒光淬滅光譜和Stern-Volmer(D)線Fig.3 Fluorescence quenched spectra of BSA by MFB at different concentration at 25℃(A)，35℃(B)and 45℃(C)，and Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of BSA by MFB(D)

從圖3(D)可看出，隨溫度升高，直線斜率增大，即KSV增大，表明MFB對BSA的熒光猝滅是由于分子間碰撞而引起的動態猝滅，主要由于升高溫度使得熒光猝滅劑分子和熒光體有效碰撞增加，擴散系數增大，從而猝滅常數增大;相反，靜態猝滅隨著溫度的升高，熒光猝滅劑分子和熒光體組成的復合物的穩定性下降，故猝滅常數減小［10］。

從表1結果可看出，Kq數量級在1012～1013，遠遠大于擴散碰撞過程中的最大Kq值，一般認為，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數為2 ×1010L·mol-1·s-1［11］，從這一點考慮，MFA 和 MFB對BSA的熒光猝滅似乎不應為動態猝滅［12］，但考慮到溶液中離子強度是影響猝滅常數的重要因素［8，11］之一，本實驗體系為緩沖溶液，故本實驗中Kq的增大可能是由離子強度引起的。

當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH可以看作一個常數，熱力學參數之間的關系如下:

根據生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律［13］，由表1可知，ΔG＜0，表明反應是自發進行的，ΔH＞0和 ΔS＞0［13］，表明MFA和MFB與BSA之間主要是疏水作用力。從MFA和MFB結構可以看出，由于MFB含有辛基側鏈［6］，疏水性明顯強于含己基側鏈的MFA，故MFB與BSA之間的疏水作用更明顯。

3 結論

采用光譜法研究了紅曲菌兩種熒光代謝產物與BSA的相互作用，結果表明紅曲菌兩種熒光代謝產物(monasfluore A，MFA 和 monasfluore B，MFB)結合BSA內源熒光的猝滅是由于紅曲菌熒光代謝產物與BSA之間形成復合物，符合動態猝滅機理。298、308、318K下，MFA與BSA和MFB與BSA的結合常數分別為:3.47 ×1012、6.35 ×1012、7.94 ×1012L·mol-1和6.90 ×1012、1.19 ×1013、1.75 ×1013L·mol-1。紅曲菌兩種熒光代謝產物與BSA之間的作用力為疏水作用力，由于MFB含有更長的辛基側鏈，具有更強的親脂性，因而與BSA之間的疏水作用力更強。

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