大豆分離蛋白與甜菜果膠靜電復合過程的研究

謝晶晶，章軼鋒，李玉輝，孔慧玲，方亞鵬

(湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北武漢430068)

蛋白質和多糖是兩類重要的天然高分子，單獨使用時其性能無法滿足實際需要，而蛋白質與多糖的復合物顯示出更為優越的性能［1］。研究者利用蛋白質與多糖的相互作用設計和制作出新穎且具有更多功能(比如組織結構、質地、形態、氣味等)的食品［2-3］。蛋白質與多糖的相互作用特別是靜電復合被證實受一系列因素的影響，包括pH、離子強度、離子類型、蛋白質與多糖比例、電荷密度、高分子的形狀和尺寸等。在諸多因素中，蛋白質與多糖比例、pH和離子強度是關鍵因素，因為它們決定了蛋白質與多糖攜帶的電荷數量［4-6］。在一定的pH下，作為電解質的蛋白質與多糖可能發生靜電相互作用，且隨著蛋白質與多糖比例的不同，形成不同的復合物:包括可溶復合物，液態凝聚物或固體沉淀［7-8］。在國內，利用蛋白質與多糖的相互作用研究復合物的凝膠質構特性、起泡性、乳化穩定性等已有一些報道［9-11］，但有關蛋白質和多糖的相互作用機理及具體結構演變的實驗鮮有報道。本文研究了GDL在線酸化誘導SPI與SBP之間的靜電復合，探討復合物的形成機理及結構演變過程，建立靜電復合物在pH-混合比率坐標下的詳細相圖。該研究為蛋白質與多糖混合體系的復合凝聚提供了進一步的理論補充，為提高和擴展蛋白質-多糖體系的功能性提供了依據。在低pH時，SPI接近等電點而發生溶解性不好的現象，限制了SPI在食品中的應用，擬通過向SPI中添加一定量的SBP提高SPI在低pH情況下的可溶性［12］。SBP含有一定量的蛋白質，具有很好的乳化活性，但缺乏良好的乳化穩定性，擬通過向SBP中添加大豆分離蛋白提高SBP的乳化穩定性［13］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPI 安陽漫天雪食品制造有限公司，MW=5.216×104u，90%蛋白質，9%水分，1%灰分;SBP 日本三榮源有限公司，MW=2.263×106u;GDL 美國Sigma公司;微孔濾膜 上海半島實業有限公司凈化器材廠;疊氮化鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

SRT202滾軸式混合器 廈門市其林貝爾儀器制造有限公司;GL21M智能高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;EL204分析天平、ORION 4 STAR pH酸度計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Zetasizer Nano-ZS激光粒度及電位滴定分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI和SBP溶液制備 分別取1g粉末溶于100g去離子水(加入0.005wt%疊氮化鈉防止微生物生長)，置于滾軸式混合器上搖勻過夜，待溶解充分后，在10000r/min下冷凍離心50min后取上清液，SPI上清液用0.22μm過濾膜(混合纖維素酯膜)過濾，SBP上清液用0.45μm過濾膜(混合纖維素酯膜)過濾。取5～6g過濾后樣品稱得質量為W1，通過烘干干重法烘干后稱得質量為W2，測定其樣品濃度，濃度(%)=(W2/W1)×100。

1.2.2 SPI/SBP混合物制備 根據所需不同混合比例，配制 SPI與 SBP混合液共 40g(總濃度為0.1wt%)，從混合液中稱取3份，每份10g，用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl將混合液pH調為8.0，待用。1.2.3 ξ-電位測定 分別稱取0.1wt%SPI、0.1wt%SBP及不同混合比例的SPI/SBP溶液(總濃度為0.1wt%)12g左右，使用Zetasizer Nano-ZS激光粒度及電位滴定分析儀在溫度為25℃時測定不同pH下的ξ-電位(光散射檢測角度為 17°，激光器波長633nm，He/Ne氣體激光器功率4mW)。設置pH從10.0降至2.0，pH每變化0.5時記錄ξ-電位。

ξ-電位可以用來表征體系的帶電情況，在施加電場下，帶電粒子會發生電泳遷移，Henry方程描述了ξ-電位和電泳遷移率UE間的關系:

式中:ξ(mV):體系 ξ-電位，η(Pa ﹒ s):分散體系粘度，ε:分散體系介電常數，f(ka)為 Henry 函數［14］。

1.2.4 GDL在線酸化過程 將1.2.2配制好的10g混合物，根據需要，添加不同質量的GDL。GDL在水溶液中水解為葡萄糖酸，形成葡萄糖酸和葡萄糖酸內酯的平衡溶液，葡萄糖酸可釋放H+，使得溶液酸化。其水解過程和酸化過程緩慢，可以自動監測溶液pH的連續變化。迅速搖勻后，采用ORION 4 STAR pH酸度計連續測定200min內混合物在酸化過程中pH隨時間的變化，測定溫度為25℃。

1.2.5 在線酸化過程中散射光強和流體力學半徑的測定 將1.2.2配制好的10g混合物，添加GDL迅速搖勻后，取1mL樣品置于樣品池中，用Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀(光散射檢測角度為173°，激光器波長633nm，He/Ne氣體激光器功率4mW)連續測定200min內混合物在酸化過程中散射光強(I173)和流體力學半徑(Rh)隨時間的變化，每分鐘讀取數值一次，測定溫度為25℃。

1.2.6 在線酸化過程中濁度的測定 將1.2.2配制好的10g混合物，添加GDL迅速搖勻后，取3mL樣品置于樣品池中，用去離子水做空白對照，用紫外可見分光光度計在500nm波長下連續測定200min內混合物在酸化過程中濁度(τ)隨時間的變化，每分鐘讀取數值一次，測定溫度為25℃。

2 結果與討論

2.1 SPI/SBP體系的ξ－電位

pH滴定過程中ξ-電位的變化可以反映整個體系在不同pH下的帶電情況。ξ-電位是粒子間靜電相互作用的標尺，可以用來預測分散體系的穩定性。體系穩定與否通常以ξ-電位的絕對值是否大于30mV為標準。圖1反映了SPI、SBP和SPI/SBP混合體系(SPI/SBP=2/1)pH滴定過程中ξ-電位的變化。當pH降至6.0時，SPI體系ξ-電位急劇增加，至pH3.0時趨于平緩。由圖可知，純SPI的等電點為4.4。蛋白質分子同時含有羧基和氨基，在pH高于等電點一側時，蛋白質帶有凈負電荷，在低于等電點一側時，蛋白質帶有凈正電荷。當pH降至5.0時，SBP的ξ-電位急劇增加。純SBP溶液在pH＞5.0時，ξ-電位值大約為-40mV，當pH降至2.0時，體系的ξ-電位值接近0，這是由SBP所帶羧基基團在酸化過程中發生質子化所致［4］。對于 SPI/SBP=2/1，其等電點約為2.9，介于SPI和SBP的等電點之間。

圖1 ξ-電位隨pH的變化Fig.1 ξ-potential as a function of pH

表1給出了不同混合比例下SPI/SBP的等電點。由表可知，隨著混合體系中SBP含量的增加，等電點逐漸降低。這是因為較多SBP存在時，SPI需要在更加酸性的條件下，增加自身所帶正電荷，才能中和SBP。當pH高于混合體系的等電點時，整個體系呈負電狀態，說明體系中SPI所帶的正電荷還不足以完全中和SBP所帶的負電荷，當pH低于混合體系的等電點時，蛋白質所帶正電荷多于SBP所帶的負電荷，整個體系呈正電性。

表1 不同混合比例下SPI/SBP體系的等電點Table 1 Isoelectric point of SPI/SBP mixtures as a function of mixing ratio

很多報道證實當體系中蛋白質與多糖帶相反電荷時，會發生靜電吸引，生成復合物［7，15］。所以對于SPI/SBP混合物，復合物的形成應該發生在pH＜4.4，即低于SPI的等電點。

2.2 SPI/SBP靜電復合過程中散射光強與濁度的變化

散射光強可反映膠體粒子的大小，濁度則是因樣品的吸收或顆粒的散射而造成透射光的衰減，同樣可以反映粒子的大小。散射光強對分子水平上的結構變化比較敏感，而濁度則相對于大顆粒(如微米級別)比較敏感。因此，綜合散射光強和濁度的變化趨勢可以用來反映不同尺寸、不同結構以及不同穩定性的復合物的形成過程。酸化過程中SPI/SBP混合體系的散射光強和濁度變化如圖2和圖3所示。在不同混合比例下，散射光強和濁度隨pH的降低都出現先緩慢增加后急劇上升再迅速下降的過程。隨著SBP含量的增加，即SPI/SBP的降低，達到最大散射光強和濁度所對應的pH逐漸下降，這與不同比例混合體系等電點的變化趨勢是相似的。

圖2 GDL酸化過程中不同混合比例的SPI/SBP散射光強(173°，I173)隨pH的變化Fig.2 Scattered light intensity at 173°(I173)as a function of pH during GDL-induced acidification for SPI/SBP mixtures with different mixing ratios

在連續測試過程中，散射光強先增加意味著溶液中可溶粒子發生了復合，隨后散射光強的減弱可能是粒子顆粒尺寸增大、顆粒數量減少所致［16］。濁度的增加意味著顆粒的尺寸已增大至可見光波長范圍，比如500nm，隨著顆粒尺寸的進一步增大，濁度急劇上升至最大，之后由于重力影響，顆粒沉降，濁度減小。

2.3 SPI/SBP靜電復合過程中特征結構轉變點的確立

圖3 GDL酸化過程中不同混合比例的SPI/SBP濁度(500nm，τ)隨pH的變化Fig.3 Turbidity at 500nm as a function of pH during GDL-induced acidification for SPI/SBP mixtures with different mixing ratios

比較SPI/SBP=2/1體系的散射光強、濁度和流體力學半徑隨pH的演變，如圖4所示。pH5.5～4.3這個區間，散射光強和濁度值都很低，并基本保持不變。當pH＜4.3時，散射光強開始出現增加，該初始點定義為pHc。當4.3＜pH＜3.6時，散射光強顯著增加并迅速到達最大值，說明多糖和蛋白質發生了顯著的復合，散射光強達到最大值時的pH定義為pHφ。同時在該pH區間內，濁度無顯著變化，說明形成的復合尺寸仍然小于可見光的波長，為納米級別的可溶復合物。當pH＜3.6時，濁度急劇增加并隨后降低，說明體系開始形成尺寸較大的復合物，并發生了沉降。當pH＜3.3時，濁度達到最大的同時流體力學半徑迅速增大，并保持增長趨勢，形成了肉眼明顯可見的沉淀，說明體系形成了微米級別的不可溶復合物。

圖4 GDL酸化過程中SPI/SBP=2/1混合體系散射光強，濁度以及流體力學半徑的演變比較Fig.4 Comparison of the evolutions of scattered light intensity，turbidity and hydrodynamic radius during GDL-induced acidification for SPI/SBP=2/1

2.4 SPI/SBP靜電復合物的相圖

特征pH，如上述定義的pHc和pHφ對確定分子復合物的結構和性質至關重要。傳統意義上，pHc表示散射光強開始緩慢增加，相互作用變得明顯，形成了可溶分子復合物。pHφ表示散射光強達到最大，不可溶分子復合物開始形成。結合不同比例下SPI/SBP混合體系的pHc，pHφ以及SPI的等電點，繪制了SPI/SBP靜電復合物在pH-混合比率坐標下的相圖，如圖5所示。

該相圖分為四個區域:

(I):共溶高分子穩定區，該區域位于SPI等電點及pHc之上，SPI與SBP都帶有較多的負電荷，兩者之間的相互作用力以靜電排斥為主，因此它們不能形成靜電復合物。SPI和SBP以共溶的單個分子存在。

(Ⅱ):分子內可溶復合物穩定區，該區域處于SPI的等電點以下及pHc之上。由于pH在SPI等電點以下，SPI帶有凈的正電荷，因此SPI與SBP可通過靜電吸引力形成復合物。在該區域內，SBP相對于SPI過量，因此形成的復合物以SBP分子內復合物占主導［17］。此時，混合體系的ξ-電位小于-30mV(如圖1)，分子內復合物之間靜電排斥力仍然較強，使它們彼此分開而不至于形成分子間復合物。

(Ⅲ):分子間可溶復合物亞穩態區，該區域處于pHc和pHφ之間。隨著pH的降低，SPI所帶正電荷增加，超出了SBP提供的復合位點，此時過量的SPI可作為橋連點，連接不同的SBP分子進而形成SBP分子間復合物。在該區域內，混合體系的ξ-電位處于-30～-15mV之間，復合物之間的靜電排斥力變弱，SPI與SBP間的短程靜電吸引力可克服SBP分子內復合物之間的遠程靜電排斥力，通過SPI的橋連作用，SBP分子內復合物轉化為SBP分子間復合物。在該區域內分子間復合物的尺寸增長仍然受靜電排斥力的限制，復合物保持可溶性，但是已經出現不穩定性，為亞穩態結構。

(IV)分子間不可溶復合物，該區域的pH處于pHφ以下。隨著pH的進一步降低，SPI攜帶更多的正電荷，混合體系的ξ-電位＞-15mV，分子復合物間的靜電排斥力進一步減弱，體系穩定性顯著變弱，在SPI橋連的作用下，SBP分子間復合物進一步發生交聯、聚集，形成尺寸更大的復合物，并最終出現相分離或絮狀沉淀。通過光學顯微鏡可觀察到SPI/SBP體系形成了絮狀沉淀。

圖5 SPI/SBP靜電復合物的相圖Fig.5 Phase diagram for the electrostatic complex of SPI/SBP

3 結論

本文利用動態光散射、濁度法以及電位滴定等多種互補手段，系統研究了GDL在線酸化誘導的SPI與SBP之間的靜電復合。通過散射光強和濁度變化過程中的特征pH，并結合ξ-電位，建立了SPI/SBP靜電復合物的詳細相圖，討論了不同相區中復合物的性質、結構及穩定性。該研究為蛋白質與多糖混合體系的復合凝聚提供了進一步的理論補充，為提高和擴展蛋白質-多糖體系的功能性提供了依據，比如可用來指導蛋白質-多糖復合物作為新型食品乳化劑的應用［17］。

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