提取溫度與提取時間對真鱈魚骨明膠理化性質的影響

王珊珊，盧玉坤，楊 霞，常鈺菲，解 銘，李八方

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

明膠是膠原蛋白經過不可逆水解轉化而成的變性纖維狀蛋白，其主要成分為氨基酸組成相近但分子量分布很廣的水溶性多肽混合物。明膠作為功能性添加劑，具有優良的膠體保護性、粘稠性、穩定性和浸潤性，因此被廣泛應用于食品和醫藥等行業［1］。傳統明膠是使用陸生動物(主要是豬、牛等)的皮、骨和筋腱等結締組織通過酸或堿處理后，經蒸煮、提取和濃縮而制成。在提取過程中，由于溫度、溶劑、pH和時間等因素的差異，明膠大分子會表現出不同的構象，其功能特性也會隨之改變。近年來全球對明膠的需求量持續上漲，但隨著瘋牛病等人畜共患疾病的出現，傳統明膠的安全性受到廣泛質疑。水產明膠由于具有更高的使用安全性，且不受地區和宗教因素限制，因而具有廣闊的市場應用前景［2］。目前水產明膠主要是由魚皮制得，其開發應用意味著水產業每年產生的大量加工副產物能夠得到合理利用。太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)作為重要的商業捕撈品種，每年的平均年捕撈量已超過25萬t。在我國，真鱈主要用于冷凍鱈魚魚片的生產，隨之產生的大量皮、骨等下腳料至今沒有得到充分有效地利用。魚皮做為水產明膠的原料已經得到較多研究［3］，而從魚骨中提取明膠并探討其理化性質的研究目前還相對較少［4］。本實驗使用太平洋真鱈為原料，研究提取溫度與提取時間對魚骨明膠理化性質的影響，為實現魚骨明膠作為食品等功能性添加劑的產業化生產提供理論依據。

表1 基本成分分析Table 1 Proximate analysis of samples

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)魚骨 取自青島福生食品有限公司，原料獲取后，經清洗并去除雜質，冷藏于-18℃冰箱中備用;HCl、對二甲氨基苯甲醛、氯胺T、高氯酸、乙二胺四乙酸二鈉等試劑 均為國產分析純。

HHS-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;Alpha 1-4LD型冷凍干燥機 德國CHRIST公司;Nicoletnexos型傅立葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司;Hitachi 835-50氨基酸自動分析儀 日本日立公司;JSM-840型掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 明膠樣本的提取流程如下［5］:將經過預處理清洗的魚骨使用4%鹽酸溶液處理18h，溶脹結束后，魚骨清洗至中性勻漿。熱水提取溫度分別設置為45、70℃，不同提取溫度的提取時間分別設置為4、8h。熱水提取后離心獲得上清液，冷凍干燥后得到4種熱水提取明膠(Hot-water extracted gelatin，HEG)樣品:45℃ 4h，45℃ 8h，70℃ 4h 和70℃ 8h。

1.2.2 基本成分的測定 水分測定:恒溫干燥法(GB 5009.3-2010)［6］;蛋白質測定:凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)［7］;脂肪測定:乙醚抽提法(GB/T 14772-2008)［8］;灰分的測定:灰化法(GB 5009.4-2010)［9］;羥脯氨酸測定:ISO3496:1978(E)［10］方法。

1.2.3 凝膠強度分析 凝膠的制備:將HEG樣品溶解于 60℃蒸餾水中，使樣品終濃度達到 6.67%(w/v)。攪拌溶液至樣品全部溶解，將溶液置于4℃陳化18h。

凝膠強度的測定(GB 6783-94)［11］:以直徑為12.7mm的圓柱，壓入含有6.67%HEG的膠凍表面以下4mm時，所施加的力為凍力，以Bloom g為單位。1.2.4 濁度分析 配制濃度為6.67%的HEG樣品水溶液，并使用紫外-可見分光光度法在360nm下測試溶液的濁度［12］。

1.2.5 乳化性質分析 根據Pearce等人的方法，測定HEG樣品的乳化性與乳化穩定性［13］。配制濃度分別為10、20、30mg/mL的HEG樣品溶液，量取該溶液22.5mL與7.5mL的大豆色拉油相混合。設定高速組織分散機參數為20000r/min，對混合液乳化1min。使用微量進樣器從底部迅速吸取50μL乳化液和5mL 0.1%SDS溶液混合均勻，然后在500nm處測其吸光度?？瞻资褂?.1%SDS溶液。樣品乳化性(Emulsifying Activity Index，EAI)和乳化穩定性(Emulsifying Stability Index，ESI)的計算公式如下所示:

式中:A0代表0min的吸光度;A10代表乳化液10min后所測定吸光度;L代表比色皿光徑為0.01m;N代表稀釋倍數為100;C代表形成乳化液前蛋白質溶液中蛋白質的濃度，g/m3;Φ代表乳化液中油體積分數是0.25;Δt代表10min。

1.2.6 起泡性質分析 按照Shahidi等人的方法測定HEG的起泡性和起泡穩定性［14］。配制濃度分別為10、20、30mg/mL的HEG樣品溶液，量取一定體積V0的溶液，在高速組織分散機中以13400r/min轉速攪拌2min，然后立即測定攪拌后的總體積V1，靜置40min后，記下總體積V2。泡沫膨脹率(Foam expension，FE)和泡沫穩定性(foam stability，FS)。計算公式如下:FE(%)=(V1-V0)/V0×100;FS(%)=V2/V0×100。

1.2.7 傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析 在干燥條件下，將適量樣品和KBr在瑪瑙研缽中充分研磨混勻。取樣品手動壓片，將樣品放入樣品室，使用Nicolet-200SXV傅立葉紅外光譜儀對樣品在4000～500cm-1區間掃描，分辨率設置為2cm-1。

1.2.8 氨基酸組成分析 將樣品用6mol/L鹽酸于110℃水解24h，脫酸后使用Hitachi 835-50氨基酸自動分析儀進行測定。

1.2.9 掃描電鏡(SEM)觀察 將本實驗1.2.3部分所制備的6.67%(w/v)HEG凝膠切成1mm厚的小塊，使用2.5%(v/v)戊二醛溶液(pH7.2)固定12h。將樣品清洗后逐級脫水。將脫水后的樣品折斷，將自然斷面作為觀察面，真空噴金后使用JEOL JSM-840型掃描電鏡(SEM)對樣品顯微結構進行觀察［15］。

2 結果與討論

2.1 基本成分的測定

HEG樣品的蛋白含量隨著提取溫度和提取時間的提高而有所增加，這可能是因為在較高的提取溫度和較長的提取時間下，熱力能夠充分斷開膠原纖維分子內和分子間的共價交聯及氫鍵，提高了蛋白得率。熱水提取制備明膠樣品的灰分均小于1%，脂肪成分小于0.01%，這說明熱水提取工藝能夠有效避免非明膠成分的抽提。

2.2 凝膠強度分析

如圖1所示，HEG的凝膠強度隨著提取溫度的升高而顯著降低，與45℃HEG凝膠樣品相比，70℃制備的HEG樣品凝膠強度急劇下降(p＜0.05)。由于提取條件的不同，熱水提取法制備膠原蛋白會導致膠原蛋白分子在不同程度上的水解［16］。膠原蛋白分子中的一部分α鏈及低聚體會在適度的水解過程中釋放出來形成氫鍵，有利于分子的聚集和凝膠交聯的形成。但隨著提取溫度的升高和提取過程的繼續進行，蛋白分子水解加劇。由于α鏈的過度降解，凝膠在陳化過程中無法形成有序交聯，從而導致凝膠強度的下降。由圖1可見，在一定的提取時間內，高溫對明膠凝膠能力的破壞尤為顯著。

圖1 提取溫度和提取時間對凝膠強度的影響Fig.1 Effect of different extraction times and temperatures on the gel strength

2.3 濁度分析

HEG溶液的濁度隨著提取溫度的上升和提取時間的延長而提高。HEG溶液濁度的提高通常伴隨著凝膠強度的減少。當提取時間相同時，70℃提取的HEG樣品濁度顯著高于45℃制備的HEG樣品濁度(p＜0.05)，相應70℃HEG樣品的凝膠強度下降到最低值。蛋白分子發生無序錯誤的聚集有可能導致凝結塊的形成，引起溶液濁度提高，并最終造成凝膠網狀結構的紊亂，造成凝膠強度的減少［17］。當蛋白分子在高溫條件下無序聚集程度增高時，溶液的濁度也隨之增大［18］。

圖2 提取溫度和提取時間對濁度的影響Fig.2 Effect of different extraction times and temperatures on the turbidity

2.4 乳化性質分析

HEG樣品的乳化性和乳化穩定性隨提取溫度和提取時間的提高而降低。膠原蛋白分子在熱水提取的過程中會逐漸水解，產生低分子量的肽段，并暴露出親水性基團。高溫(70℃)和長時間(8h)熱水提取所得HEG具有更高的親水性，易于留在水相而非油-水界面。低溫(45℃)和短時間(4h)熱水提取所得HEG更易于在油-水界面富集并降低界面張力，其乳化性和乳化穩定性顯著高于高溫(70℃)條件下制備的HEG樣本(p＜0.05)。乳化穩定性主要取決于界面膜中蛋白質間的靜電斥力。Surh等［19］人發現在水包油型乳狀液中分子量較高的膠原蛋白片段乳化穩定性更佳，高分子量蛋白質所形成的界面膜厚度較大。

表2 提取溫度和提取時間對樣品乳化性質的分析Table 2 Effect of extraction temperatures and times on emulsifying properties

如表2所示，盡管多數測定結果之間差異并不顯著，但HEG的乳化能力和乳化穩定性一般隨蛋白質濃度增大而有增高的趨勢。主要原因是蛋白分子在油-水界面上吸附，隨著蛋白濃度的增加，吸附層逐漸形成更加緊密的、具有一定厚度和強度的界面膜。但乳化性質也有隨濃度增高而降低或者增加不顯著的例子，例如在70℃提取8h條件下提取的HEG其乳化穩定性在蛋白質濃度為3%時與2%時相比并未有所增高。這可能是因蛋白濃度超過一定值，即使再增加蛋白分子的數量，其結合油的量也不會再發生明顯變化，界面膜的厚度和強度增加亦隨之變小，故其穩定性未能提高。

2.5 起泡性質分析

如表3所示，HEG樣品的起泡性和起泡穩定性隨其濃度的增高而有顯著性上升(p＜0.05)。高濃度蛋白溶液的界面膜較厚，因此泡沫更為密集和穩定。如果蛋白質分子在起泡過程中能夠快速富集于氣-液界面，同時在界面上分子發生重排反應并結構伸展，則其起泡性能更好［20］。分子量較小的蛋白分子更易富集到氣-液界面，形成較為堅韌的液膜。起泡穩定性與多種因素有關，例如達到平衡表面張力的速率、體積黏度和表面黏度和液膜兩側的電斥力等［21］。隨著提取溫度的升高和提取時間的延長，HEG分子逐漸發生降解，肽鏈展開且極性基團暴露，分子易于與液膜結合，增加了液膜的韌性，使起泡穩定性得以提高。

表3 提取溫度和提取時間對樣品起泡性質的分析Table 3 Effect of extraction temperatures and times on foaming properties

2.6 傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析

FTIR光譜可用來研究膠原蛋白的二級結構變化，酰胺I帶是蛋白質多肽骨架C=O伸縮振動產生，是研究蛋白質二級結構變化的最有效區域［22］。由圖1可知，在一定提取時間內，高溫對HEG樣品凝膠能力的影響較為顯著，故本實驗選擇45℃及70℃8h制備的HEG樣品，比較其紅外光譜圖。由圖3可見，與未變性酸溶性膠原蛋白(ASC)［23］相比，熱水提取明膠HEG的酰胺A吸收峰變寬，酰胺A與酰胺B的吸收強度亦有所減少;HEG的酰胺I和Ⅱ峰值強度明顯減少。在兩組HEG樣品中，70℃溫度下提取制備的HEG蛋白其酰胺I吸收峰強度要弱于45℃提取的HEG樣品，這可能是由于提取溫度的提高導致了樣品分子無序程度的增加。

圖3 ASC與HEG的紅外光譜分析Fig.3 FTIR spectra of ASC and HEC extracted at different temperatures

2.7 氨基酸組成分析

HEG樣品的氨基酸組成如表4所示，在4種樣品中，甘氨酸、亞氨酸(脯氨酸+羥脯氨酸)和丙氨酸的含量較多，而組氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸的含量較少，未檢測出半胱氨酸含量。其中，脯氨酸與羥脯氨酸的含量分別在109～117與72～77之間。Regenstein等人研究認為甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸是熱水提取明膠中含量最多的氨基酸［24］。在不同提取溫度與不同提取時間下制備的4種HEG樣品其氨基酸組成并無顯著差異(p＞0.05)。

表4 氨基酸組成分析(‰)Table 4 Comparative analysis of amino acid composition of samples(‰)

2.8 掃描電鏡(SEM)觀察

在凝膠基質骨架中，蛋白分子的排列方式與其凝膠強度大小有關［25］，通常排列有序且孔洞較小的凝膠具有較好的強度。在兩組HEG凝膠樣品的掃描電鏡觀察圖中(如圖4所示)，45℃提取制備的HEG樣品凝膠結構較為緊密有序，而70℃提取制備HEG樣品凝膠中可見大量無規則排列孔洞，這說明高溫條件下制備的明膠其凝膠結構更容易被破壞。

圖4 HEG凝膠樣品的掃描電鏡(SEM)觀察圖Fig.4 SEM images of gel samples

3 結論

實驗結果顯示，隨著提取溫度的升高和提取時間的延長，HEG樣品凝膠強度、乳化和乳化穩定性隨之下降，而其濁度和起泡性能則有所上升。紅外光譜分析顯示70℃提取制備的明膠樣品其酰胺I吸收峰強度要弱于45℃提取的樣品，說明提取高溫會導致樣品分子結構無序程度的增加。在掃描電鏡觀察下，高溫制備的凝膠呈無規則結構排列，且具有大量孔洞。

［1］Johnston-Banks F A.Gelatin［M］.In P Harris(Eds)，New York:Elsevier Applied Sciences，1990:233-289.

［2］Muyonga J H，Cole C G B，Duodu K G.Extraction and physicochemical characterization of Nile perch(Lates niloticus)skin and bone gelatin［J］.Food Hydrocolloids，2004，18:581-592.

［3］Karim A A，Bhat R.Fish gelatin:properties，challenges，and prospects as an alternative to mammalian gelatins［J］.Food Hydrocolloids，2009，23:563-576.

［4］Kolodziejska I，Skierka E，Sadowska M，et al.Effect of extracting time and temperature on yield of gelatin from different fish offal［J］.Food Chemistry，2008，107:700-706.

［5］王珊珊，單銀銀，李志皓，等.真鱈魚骨明膠的提取工藝及性質研究［J］.食品與發酵工業，2012，38(7):152-156.

［6］GB 5009.3-2010.食品安全國家標準食品中水分的測定［S］.中華人民共和國國家標準.

［7］GB 5009.5-2010.食品安全國家標準食品中蛋白質的測定［S］.中華人民共和國國家標準.

［8］GB/T 14772-2008.食品中粗脂肪的測定［S］.中華人民共和國國家標準.

［9］GB 5009.4-2010.食品安全國家標準食品中灰分的測定［S］.中華人民共和國國家標準.

［10］ISO 3496(E).Meat and meat products-determination of L(-)hydroxyproline content(reference method)［S］.International Standardization，1978.

［11］GB 6783-94.食品添加劑 明膠［S］.中華人民共和國國家標準.

［12］Fernandez-Diaz M D，Montero P，Gomez-Guillen M C.Gel properties of collagens from skins of cod(Gadus morhua)and hake(Merluccius merluccius) and their modification by the coenhancers magnesium sulphate，glycerol and transglutaminase［J］.Food Chemistry，2001，74(2):161-167.

［13］Patel M T，Kilara A.Studies on whey protein concentrates.Foaming and emulsifying properties and their relationships with physicochemical properties［J］.Journal of Dairy Science，1990，73:2731-2740.

［14］Shahidi F，Xiao Q H，Synowiecki J.Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin(Mallotus villosus)［J］.Food Chemistry，1995，53:285-293.

［15］Kittiphattanabawon P，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Comparative study on characteristics of gelatin from the skins of brownbanded bamboo shark and blacktip shark as affected by extraction conditions［J］.Food Hydrocolloid，2010，24:164-71.

［16］Jongjareonrak A，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Skin gelatin from bigeye snapper and brownstripe red snapper:chemical compositions and effect of microbial transglutaminase on gel properties［J］.Food Hydrocolloids，2006，20:1216-1222.

［17］Pomeranz Y.Functional properties of food components［M］.San Diego:Academic Press，Inc.1991.

［18］Johnson T M，Zabik M E.Egg albumin proteins interactions in an angel food cake system［J］.Journal of Food Science，1981，46(4):1231-1236.

［19］Surh J，Decker E A，McClements D J.Properties and stability of oil-in water emulsions stabilized by fish gelatin［J］.Food Hydrocolloids，2006，20:596-606.

［20］Damondaran S.Protein-stabilized foams and emulsions［M］.In S.Damodaran and A.Paraf(Eds.).Food proteins and their applications.New York:Marcel Dekker Inc.1997.

［21］Liu J，Xu G，Yuan S，et al.The effect of macromolecules on foam stability in sodium dodecyl sulfate/cetylpyridinium bromide mixtures［J］.Journal of Dispersion Science and Technology，2003，24:779-787.

［22］Surewicz W K，Mantsch H H.New insight into protein secondary structure from resolution enhanced infrared spectra［J］.Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology，1988，952:115-130.

［23］Nagai T，Suzuki N.Preparation and Characterization of several fish bone collagens［J］.Journal of Food Biochemistry，2000，24(5):427-436.

［24］Regenstein JM，Zhou P.Collagen and gelatin from marine by-products［M］.In:Maximising the value of marine by-products.Shahidi F.(Eds)Woodhead Publishing Limited，Cambridge.2007，pp.279-303.

［25］BenjakulS，Oungbho K，Visessanguan W，etal.Characteristics of gelatin from the skin of bigeye snapper，Priacanthus tayenus and Priacanthus macracanthus［J］.Food Chemistry，2009，116(2):445-451.