應(yīng)用PCR－LDR法檢測乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥多基因突變位點

張時良，裴 豪＊，戴亞新，陸 炯

（1．無錫市傳染病醫(yī)院 檢驗科，江蘇 無錫214005；2．東華大學(xué)，上海201600）

核苷（酸）類似物是目前臨床抗病毒治療的常用藥物，但由其引起的耐藥問題也日益突出。很多研究［1－3］表明，與拉米夫定耐藥相關(guān)的基因突變有逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）基因區(qū)的 M204I／V／S、L180M、V173L等；與阿德福韋耐藥相關(guān)的突變 位 點 有 N236T、A181V／T、I233V、V214A、Q215S、L217R等；與恩替卡韋耐藥相關(guān)的突變位點有S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L 等；與替比夫定耐藥相關(guān)的突變?yōu)镸204I等。為獲得一種可以快速準確地檢測以上耐藥突變位點的方法，本實驗采用由上海東華大學(xué)提供的多重聚合酶連接反應(yīng)－連接酶檢測反應(yīng)分型法（PCR－LDR）對50例樣本進行突變位點檢測分析，以驗證該方法應(yīng)用于臨床檢測的可行性。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣本來源 2010年5月1日至31日在本院就診并運用核苷類藥物治療的慢性乙型肝炎患者50例，其中男性33例，女性17例，年齡15至69歲，平均年齡42．83±13．47歲。

1．1．2 主要試劑和儀器 HBV DNA熒光定量試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司，引物、探針由上海東華大學(xué)合成，電泳膠、緩沖液、內(nèi)參試劑均購自美國ABI公司；所用儀器為ABI 7500Real－Time PCR System，ABI PRISM 3130DNA Sequencer購自美國ABI公司。

1．1．3 引物設(shè)計 以基因庫公布的981條HBV基因序列為基礎(chǔ)，在RT區(qū)設(shè)計2對通用引物PCR1－upper，PCR1－lower 和 PCR2－upper，PCR2－lower（表1）。

1．2 方法

1．2．1 特異性寡核苷酸探針的設(shè)計 針對拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋8個耐藥位點的氨基酸替換形式，設(shè)計包括rtL180M、YMDD／YIDD／YVDD、rtA181V／T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtS202I、rtM250V的8條特異性檢測探針（表2）。

表1 PCR引物序列

1．2．2 血清HBV DNA的抽提 按照上海科華生物工程公司試劑說明書進行。

1．2．3 反應(yīng)條件 以血清提取物為模板進行PCR反應(yīng)。20μl PCR反應(yīng)體系含Taq酶1U，10X緩沖液2μl，2mMdNTP 2μl，2pmol／μl引物2μl，50 mM Mg2＋1．2μl。第一輪PCR模板為血清提取物2μl，引物為PCR1－upper、PCR1－lower、PCR2－upper、PCR2－lower，反應(yīng)條件為95℃15min；94℃30 s，54℃30s，72℃30s，45個循環(huán)；72℃5min；第二輪10μl LDR反應(yīng)體系模板為第一輪PCR產(chǎn)物2 μl，10X緩沖液1μl，2pmol／μl探針1μl，反應(yīng)條件為94℃2min；94℃30s，55℃ 2min，15個循環(huán)。產(chǎn)物保存于4℃待用。

1．2．4 測序 PCR－LDR 產(chǎn)物使用 ABI PRISM 3130DNA Sequencer進行產(chǎn)物分析，樣本直接測序由上海博尚技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持。

2 結(jié)果

2．1 PCR的靈敏度和特異性 以不同HBV DNA濃度的血清提取物為模板進行PCR檢測，終檢濃度為103copies／ml（熒光定量試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司）。陽性樣本的最終PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期值相符（PCR1－upper，low引物對的擴增物為248bp，PCR2－upper，low為231bp）。

2．2 HBV野生標準株的鑒定 為避免突變探針產(chǎn)生非特異性的突變信號，應(yīng)用直接測序法和PCRLDR法分別對HBV野生標準株分析，結(jié)果顯示，野生株在目的區(qū)段未發(fā)生耐藥突變（圖1）。由于臨床恩替卡韋耐藥相關(guān)的突變位點為S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L，其中又以 T184G／A／L 為主［4］，本實驗僅檢測到1例184位點突變。

表2 探針的名稱和序列

圖1 HBV野生標準株LDR法結(jié)果

2．3 臨床樣本血清PCR產(chǎn)物分析 選取的50例HBV DNA血清樣本中，35例樣本未檢測到耐藥突變，8例為拉米夫定耐藥突變，5例為阿德福韋耐藥突變，1例為拉米夫定和阿德福韋同時耐藥突變，1例恩替卡韋耐藥突變病毒株。將PCR－LDR法的檢測結(jié)果與直接測序法所得結(jié)果進行比對（圖2），由圖2可知其結(jié)果完全一致。由此可初步證實本方法的臨床可行性，可用于目前HBV抗病毒治療藥物耐藥的檢測。

3 討論

迄今慢性HBV感染為全球性的難題，全世界約有3．5億人感染，預(yù)知相關(guān)的年死亡人數(shù)約為1 200 000［5］。因此針對 HBV 的抗病毒治療受到廣泛重視。隨著對HBV聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能的深入認識，一些有效抑制HBV DNA復(fù)制的核苷類藥物（如拉米夫定、替比夫定、阿德福韋、恩替卡韋等）逐步成為抗HBV治療的新選擇［6，7］。由于HBV聚合酶如同其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶一樣具有較高的錯配傾向且缺乏校對能力，因此隨著感染的持續(xù)病毒準種逐年增多［8，9］。在核苷類藥物的選擇壓力下，耐藥變異株逐漸增多，最終替代野生株成為優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致臨床耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。

目前臨床檢測HBV耐藥的方法主要有直接測序發(fā)、實時熒光PCR和反向雜交法［10］。但這些方法都有其不足之處：直接測序法可以檢測HBV已知和未知的突變，但對于低滴度的樣本（小于104copies／ml）無法進行檢測，同時小于野生株20%的低豐度耐藥株序列容易被忽略，且實驗過程復(fù)雜，實驗周期長；實時熒光PCR不能同時檢測多位點突變，應(yīng)用受到限制；反向雜交法反應(yīng)步驟繁雜，應(yīng)用成本較高，試驗周期也較長。

圖2 HBV耐藥株直接測序和PCR－LDR法比對結(jié)果

我們采用PCR－LDR法構(gòu)建一次性檢測HBV核苷類藥物耐藥的多個基因突變位點的檢測方法，將PCR反應(yīng)和LDR反應(yīng)相結(jié)合，擁有PCR的高靈敏度，LDR的高特異性和測序的高精確度等優(yōu)點，結(jié)果直觀，操作簡便、快速，方法經(jīng)濟實用，完全能夠滿足針對臨床現(xiàn)有常用的核苷類藥物治療HBV耐藥檢測，為指導(dǎo)臨床使用核苷類藥物治療乙型肝炎患者提供重要的參考依據(jù)。

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