腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子修飾的BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究

于澤洋，于 濤，趙長(zhǎng)福，王志申

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130033）

骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的骨再生過(guò)程。其修復(fù)的過(guò)程就是正常胚胎骨發(fā)生過(guò)程的重演，是一系列的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的變化過(guò)程。骨折愈合機(jī)制受到機(jī)體及局部環(huán)境的多層面、多途徑的調(diào)節(jié)，在不同的愈合階段有不同的細(xì)胞參與，且有許多生長(zhǎng)因子表達(dá)水平的改變，從而影響骨折愈合速度［1－3］。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurot rophic factors，NTFs）是由多種細(xì)胞所分泌的一類(lèi)對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用的非常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通常為大分子蛋白質(zhì)或小分子肽類(lèi)物質(zhì)［4］。它們可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，促進(jìn)和支持靶細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及發(fā)育，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的代謝和功能活動(dòng)，它們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)也有著重要作用。

近來(lái)，隨著研究的深入，不斷地發(fā)現(xiàn)有新的種類(lèi)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。目前關(guān)于它們的分類(lèi)及歸屬仍不十分明確，研究比較集中的主要有神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF），腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurot rophic factor，BDNF），神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素（neurot rophin，NTs），睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurot rophic factor，CNTF），膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial derived neurot rophic factor，GDNF），胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin－like growth factor，IGF），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGFs），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF），血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF），血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。

對(duì)骨折愈合中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的研究表明，骨痂形成過(guò)程中有多種NTFs表達(dá)，包括BDNF，NGF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子23（NT23）。骨形成細(xì)胞有NTFs受體trkA 和trkC的表達(dá)［5－7］，提示 NTFs涉及骨形成的調(diào)節(jié)，但機(jī)制不清。目前已知，NGF對(duì)骨折修復(fù)的研究始于Eppley等人，他們?cè)趹?yīng)用NGF修復(fù)兔下頜神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)中，不僅證實(shí)NGF能促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在再生軸突周?chē)行律?lèi)骨質(zhì)生成［8］。BDNF是NTFs家族中重要成員，是由神經(jīng)元的靶細(xì)胞分泌，逆向營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛作用，尤其可以促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元譜系分化，維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及保護(hù)修復(fù)有重要作用，其作用范圍甚至超過(guò)NGF。在骨折愈合過(guò)程中，神經(jīng)支配和調(diào)節(jié)也有著明顯的影響。腦外傷病人骨折愈合較快；此外，一些神經(jīng)疾病患者的骨骼外成骨量也較多。

因此，本實(shí)驗(yàn)圍繞神經(jīng)因素應(yīng)用于干細(xì)胞工程與骨組織工程的可行性方面，從體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與骨形成的關(guān)系進(jìn)行討論。探討骨折修復(fù)作用中BDNF對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化、損傷修復(fù)的作用。證實(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)對(duì)骨形成的作用，為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因素應(yīng)用于骨組織工程種子細(xì)胞研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 pECFP－C1－BDNF重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切已構(gòu)建的pUCm－T－BDNF質(zhì)粒及pECFP－C1質(zhì)粒，瓊脂糖電泳鑒定后回收純化目的片段。T4DNA連接酶作用下將測(cè)序正確的BDNF基因片段與雙酶切后的載體質(zhì)粒4℃連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。小量抽提質(zhì)粒，EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ兩種雙酶切方案進(jìn)行鑒定。

1．2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下獲取的大鼠骨髓，吹打制成均勻的細(xì)胞懸液。將骨髓細(xì)胞懸液加于Percoll淋巴細(xì)胞分離液液面上（2∶1比例）。3 000rpm離心10min。去上清，吸取中間白膜層，加入PBS清洗2遍。1 800 r／min，離心10min。用含10%FBS的L－DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)至2×106／ml，接種于25mm2培養(yǎng)瓶中。置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每隔3d換液。

原代細(xì)胞長(zhǎng)至80%－90%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。胰酶消化后，加入含10%FCS的L－DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，按1∶2比例傳代接種培養(yǎng)。

1．3 pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

將細(xì)胞等量分到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔約5×105個(gè)／ml，直至細(xì)胞密度約80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑、無(wú)血清和抗生素的培養(yǎng)液恢復(fù)至室溫。轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒以3∶2的比例混合。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，以相應(yīng)的未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染相應(yīng)的空質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs BDNF的表達(dá)。

1．4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定

取P4代BMSCs，細(xì)胞正常消化，接種于6孔板內(nèi)，接種密度為1×104個(gè)／ml，正常培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒48h后，然后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2－3天換液一次，連續(xù)誘導(dǎo)3周。Von Kossa染色。將成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，95%乙醇室溫固定10min；放入2%硝酸銀，置于強(qiáng)光處作用15－60min；蒸餾水沖洗3遍，2%硫代硫酸鈉還原1h；流水沖洗5min，1%伊紅復(fù)染5min，沖洗，顯微鏡觀察。

1．5 Western Blot檢測(cè)

收集各組細(xì)胞總蛋白。制備12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠，取100μg總蛋白上樣，電泳1．5h；室溫、恒壓220V條件下，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜1h。PBST配制的5%脫脂奶粉溶液用作封閉液，室溫封閉1h；兔抗BDNF多克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜；PBST漂洗3次，每次10min；加入HRP－抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，PBST 洗3次，每次10min；PBS洗膜10min；ECL反應(yīng)3min后，暗室中X光片曝光；室溫顯影、定影。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行薄層密度掃描，記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度（IOD）值反映蛋白含量。

1．6 堿性磷酸酶的檢測(cè)

經(jīng)重組質(zhì)粒pECFP－C1－BDNF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別制成5×104個(gè)／孔的密度，鋪于24孔板中，每孔1ml，檢測(cè)堿性磷酸酶含量的變化情況。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照。采用堿性磷酸酶定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中堿性磷酸酶的含量。

2 結(jié)果

2．1 pECFP－C1－BDNF重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

pUCm－T－BDNF克隆后經(jīng)EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切后得到BDNF基因目的片段，回收純化測(cè)序結(jié)果正確無(wú)突變或缺失。重組質(zhì)粒pECFP－C1－BDNF經(jīng)EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ兩種雙酶切方案鑒定、測(cè)序后得出相同結(jié)果（見(jiàn)圖1．A，B）。

2．2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞接種24h后，部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型。接種3d后，長(zhǎng)梭形細(xì)胞增多（圖2．A）。培養(yǎng)5d左右，細(xì)胞胞體變大呈典型成纖維細(xì)胞樣，大量細(xì)胞向外放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞排列整齊，克隆顯著增多并融合成片。原代細(xì)胞培養(yǎng)7－10d左右即可傳代。培養(yǎng)在25cm2培養(yǎng)瓶中，第3代以上的細(xì)胞按1∶2比例傳代6d可長(zhǎng)至80%左右，第20代左右的細(xì)胞按1∶3比例傳代僅3d可達(dá)90%以上匯合。

圖1 A：pECFP－C1－BDNF重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ／SalⅠ酶切鑒定。B：pECFP－C1－BDNF經(jīng)EcoRⅠ／BamHⅠ酶切鑒定

圖2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖

2．3 pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

熒 光 顯 微 鏡 下 可 見(jiàn) pECFP－C1－BDNF 轉(zhuǎn) 染BMSCs效率可達(dá)80%左右（圖3．A，B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，pECFP－C1－BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs 48h表達(dá)分子量約為30kD的融合蛋白條帶（圖3．C）。

圖3 A，B：pECFP－C1－BDNF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs。C：Western blot檢測(cè)pECFP－C1－BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs后BDNF蛋白表達(dá)。

2．4 轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒的BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BMSCs組均加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)5－8天后，細(xì)胞有長(zhǎng)梭形逐漸變成多角形或不規(guī)則狀，并且體積增大。誘導(dǎo)21天后，有鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生。鈣結(jié)節(jié)的形成為成骨細(xì)胞特有。我們利用Von kussa染色礦化結(jié)節(jié)的經(jīng)典方法，細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的主要成分鈣鹽與硝酸銀復(fù)分解形成可被還原的銀鹽，在強(qiáng)光或式紫外光下生成黑色金屬銀。因此在染色結(jié)束后，粉紅色背景上有黑色顆粒的產(chǎn)生。

隨機(jī)16個(gè)視野中觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pECFPC1－BDNF質(zhì)粒組，細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的Von kussa染色黑色顆粒含量和范圍都較未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的多，初步證明了，轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒后BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率比未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BMSCs較高。BDNF在細(xì)胞中的表達(dá)有利于BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。

圖4 轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒的BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后鈣結(jié)節(jié)形成的Von kussa染色圖

2．5 堿性磷酸酶合成變化

當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至第9天時(shí)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組BMSCs細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞堿性磷酸酶含量與對(duì)照組比較均顯著升高。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞堿性磷酸酶含量為（4．78±0．30）IU／ml；而轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞堿性磷酸酶含量為（5．88±0．19）IU／ml。提示pECFP－C1－BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞后，BDNF蛋白的表達(dá)使細(xì)胞更易于向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，使細(xì)胞所分泌的堿性磷酸酶量呈顯著性升高（P＜0．05）。

圖5 轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)粒后BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)堿性磷酸酶合成含量的變化

3 討論

骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復(fù)反應(yīng)，是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其他多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程。骨折不同的愈合階段有不同的細(xì)胞及細(xì)胞因子參與，骨形成過(guò)程受多種因素調(diào)控［5－7］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的一類(lèi)具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是骨髓基質(zhì)的重要組成成分［9－11］。在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs具有向成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，心肌細(xì)胞等多向分化的能力，并可通過(guò)分泌一些可溶解因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF），bFGF和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）等促進(jìn)神經(jīng)再生。BMSCs由于具有多分化潛能，容易在體外擴(kuò)增，容易轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)而成為基因治療的良好靶細(xì)胞。BMSCs已經(jīng)在眾多臨床前期實(shí)驗(yàn)中被用于修復(fù)各種組織損傷。已有研究表明，骨折治療中，導(dǎo)入NGF－BMSC，不僅能誘導(dǎo)BMSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，它分泌的NGF還能加速骨折愈合，從而達(dá)到更理想的效果。Eppley等發(fā)現(xiàn)，NGF具有骨折修復(fù)的潛能［8，12，13］。

BDNF是NTFs家族中重要成員，是由神經(jīng)元的靶細(xì)胞分泌，逆向營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛作用，尤其可以促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元譜系分化，維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及保護(hù)修復(fù)有重要作用，其作用范圍甚至超過(guò)NGF。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pECFP－C1－BDNF。在研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pECFP－C1－BDNF質(zhì)?？梢杂行У脑贐MSCs內(nèi)表達(dá)BDNF蛋白，并且加速BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的進(jìn)程，有利用BMSCs在骨損傷部位分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨折愈合，對(duì)骨折后損傷部位的組織修復(fù)等具有重要的作用。本研究對(duì)BDNF基因修飾型細(xì)胞移植治療臨床疾病提供了一條有效、安全的新的發(fā)展方向。

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