SEA對PLA801D細胞體外生物學行為影響及相關機制

王力玄，任 錦，吳艷峰，周佳瑩＊

（1．吉林大學白求恩醫學院09級臨床醫學專業，吉林 長春130021；2．吉林大學第二醫院 呼吸內科，吉林 長春130041）

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全身化療是目前大多數肺癌患者的主要治療手段。但是，多藥耐藥（MDR）嚴重影響化療效果及預后，是臨床亟待解決的問題［1］。因此，深入了解肺癌的耐藥機制，嘗試新的方法以防止或逆轉耐藥性，對提高肺癌的治療效果及患者生存率有重要意義。本研究應用超抗原葡萄球菌腸毒素A（SEA）觀察其對人肺巨細胞癌株（PLA801D）細胞的生物學行為，旨在為人肺癌的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 PLA801D細胞株由北京解放軍總醫院提供，SEA由軍事醫學科學院微生物流行病學研究所提供，噻唑藍（MTT）試劑，RPMI 1640培養基為美國sigma公司產品，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1．2 方法

1．2．1 MTT比色法 取對數生長期的PLA801D細胞，0．25%胰蛋白酶消化，調細胞數為2×105／ml，接種于96孔塑料培養板內每孔100μl，當細胞生長達到80%匯合時，分組，0ng／ml組、20ng／ml組、40ng／ml組和80ng／ml組，每個濃度10復孔，靜止培養24h，于結束前6h加入MTT試劑20nl／孔，終濃度為500mg／L繼續培養6h后，棄上清，每孔內加入DMSO（二甲基亞砜）150nl，振蕩5min，使MTT還原產物完全溶解，應用酶標儀于570nm處測定各孔吸光度A值，按下列公式計算PLA801D細胞增殖抑制率，每組實驗重復3次，取平均值。

PLA801D細胞抑制率＝（1－加藥組細胞A值÷對照組細胞A值）×100%

1．2．2 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞培養及分組同1．2．1，不同之處是將96孔塑料培養板改為25毫升培養瓶進行，每個濃度3瓶，培養結束后用0．25%胰蛋白酶消化，收集細胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃內保存，上機前過40目網，調細胞數1×106／ml，PI染色，流式細胞儀檢測，細胞周期結果以 Modiff 2．0軟件分析。

1．2．3 透射電子顯微鏡技術 細胞培養及分組同1．2．2，收集不同濃度的SEA作用后的PLA801D細胞，移入錐型離心管內，離心棄上清，應用2．5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛－鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1．2．4 統計學處理 所有數據結果以ˉx±s%表示，統計學采用SPSS 11．0軟件分析，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2．1 MTT結果 不同濃度的SEA對PLA801D細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異有顯著意義。見表1。

2．2 流式細胞儀結果 不同濃度的SEA對PLA801D細胞增殖周期均有影響。G1期細胞增多，S期細胞減少，G2／M期相對增多，組間比較差異顯著。見表2。

表1 SEA對PLA801D細胞增殖抑制率

表2 SEA對PLA801D細胞增殖周期各時相影響及凋亡率

2．3 透射電子顯微鏡觀察結果 透射電子顯微鏡觀察不同濃度的SEA對PLA801D細胞的超微結構改變，可見線粒體腫脹、有大量空泡形成、細胞核染色質趨邊凝集，可見凋亡小體改變。見圖1、2。

圖1 20ng／L SEA對PLA801D細胞作用，可見線粒體腫脹、有空泡形成（5000×）

圖2 80ng／L SEA對PLA801D細胞作用，可見染色質趨邊凝集、可見凋亡小體（5000×）

3 討論

腫瘤生物治療是一類應用細胞生物學和分子生物學手段對機體免疫系統或腫瘤生長進行調節，從而抑制腫瘤生長［2］。因此，本研究應用超抗原SEA觀察其對PLA801D細胞的生物學行為變化，SEA是一組對熱穩定的可溶性蛋白質，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因［3］。MTT結果顯示，不同濃度的SEA對PLA801D細胞增殖抑制率分別為22．8%、33．7%和42．1%，具有明顯的劑量依賴性，與對照組相比差異非常顯著，P＜0．01。因為 MTT試劑可被哺乳動物活細胞線粒體中的脫氫酶還原成藍色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細胞數目及細胞活化狀態呈線性關系。因此，該實驗被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細胞毒性實驗研究，具有一定的客觀性和實用性。

流式細胞儀結果顯示，不同濃度的SEA對PLA801D細胞周期進程均有影響，SEA可抑制G1期細胞向S期轉化進程，從而使G1期細胞增多，S期細胞減少，G2／M期細胞相對增多，G1期細胞又稱細胞復制前期，G1期是制造和產生rRNA、mRNA和tRNA及核蛋白體，同時G1期也是多種化學藥物作用的敏感點［4］。因此，抑制G1期細胞的進程從而使細胞增殖變緩，不能進入S期，造成S期細胞減少，達到抑制腫瘤增殖的目的，而G2／M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映［5］。G2／M期是細胞周期的兩個檢查點之一，是細胞增殖的重要階段，多種DNA損傷劑不僅可引起G1期阻滯，也可引起G2／M期阻滯，由于G2／M期阻滯在細胞增殖和凋亡中的作用，使人們聯想到它可能與細胞基因組不穩定性，腫瘤發生和治療密切相關。因此，這方面研究日益受到重視。

綜上所述，本研究應用SEA體外觀察其對PLA801D細胞生物學行為影響，獲得了較為滿意的結果。證明SEA具有直接的細胞毒作用，與文獻報道相一致［6］，可以用于腫瘤局部免疫治療，具有一定的優越性。

［1］Anglim PP，Alonzo TA，Laord－Offringa IA．DNA methylation based biomarkers for early detection of non－small cell lung cancer：an up－date［J］．Mol Cancer，2008，7：7．

［2］黃 健，李官成．抗體藥物用于腫瘤治療的研究進展［J］．國際腫瘤學雜志，2008，35（5）：351．

［3］Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al．Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins［J］．Chem Immunol Allergy，2007，93：24．

［4］Martin LG，Demers GW，Galloway DW，Disrup－tion of the G1／S traansition in human Papiloma Viras type／6E7－expressing human cells in associated regulation of cyclin E ［J］．Virol，1998，72（2）：975．

［5］Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al．Ste20－like kinase（SLK），a regulatory kinase for polo－like（PLK）during the G2／M transition in somatic cells［J］．Genes Celss，2005（6）：491．

［6］張 云，孫嘉琳，王 雪，等．SEA體內殺傷S180肉瘤效果及其細胞因子測定［J］．天津醫藥，2010，38（4）：313．