多重PCR在診斷無癥狀性尿道炎、宮頸炎人群中的臨床應用

范世珍，林松青，陳安彬（深圳市福田區(qū)中醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518034）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）、生殖支原體（Mycoplasma genitalium，Mg）和陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis，Tv）是引起性傳播疾病（Sexually transmitted disease，STD）最常見的病原體[1-3]。然而，這些病原體感染后往往缺乏典型的臨床癥狀，這給臨床診斷帶來了一定的困難。對于無癥狀性STD患者而言，常規(guī)的細菌培養(yǎng)陰性結果往往容易導致他們忽視自己的病情，從而成為危害極大的傳染源。因此，本研究旨在評價多重PCR技術在無癥狀患者的性傳播感染如尿道炎、宮頸炎相關病原體的篩查中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標本采集 本文所入選的216例研究對象為2010年7月至2011年12月本院體檢人群，其中男性124例，女性92例，年齡平均（31.4±10.1）歲，所有研究對象在納入研究前均自愿參與并進行了簡要的問卷調查。所有研究對象處于性活躍期且無臨床癥狀，年齡在20～60歲。性活躍的定義為連續(xù)3個月內有性生活。若3個月內曾有泌尿生殖道感染史，但納入研究時已被治愈的研究對象不納入本文研究范圍。

1.2 DNA提取 收集50 ml男性首段尿，女性在婦科醫(yī)生的協(xié)助下使用宮頸拭子標本。于室溫離心10 min，棄上清，加入1 ml無菌PBS重懸。DNA的提取根據廠家試劑盒提供的方案進行。未及時用于多重PCR的DNA置于-20℃保存。

1.3 多重PCR反應 多重PCR的擴增按照試劑盒說明書步驟進行。本試劑盒中含有Ct等6種病原體保守基因序列中的特異性引物，并含有用于排除標本抑制物存在的內參PCR mix和陽性對照樣品。本實驗用的PCR儀為Eppendorf公司梯度PCR儀。PCR結束后電泳觀察結果，預期片段處出現反應條帶判斷為陽性。

2 結果

2.1 病原體檢出情況 在216例研究對象中，95例（43.98%）患者泌尿生殖道內至少存在一種微生物感染。Ct、Ng、Mg、Uu、Mh和Tv在無癥狀人群中的感染率見表1。

表1 無癥狀人群中6種病原體的檢出情況[例（%）]

2.2 混合感染情況 在所有研究對象中Ct、Ng、Mg和Tv單一感染分別為10例、1例、1例、2例。此外，多重感染也常見，主要是Ct合并Mh或Uu感染。在感染有Ct的人群中，Uu和Mh的感染率分別為27.8%（5/18）和33.3%（6/18）。此外，Mg和Tv與其他細菌混合感染也常見，見表2。

表2 無癥狀人群中病原體混合感染情況[例（%）]

3 討論

Ct、Ng、Mg、Tv等是引起無癥狀性尿道炎、宮頸炎最重要的病原體[4]。在本研究中，這4種病原體的感染率達12.04%（26/216）。經多重PCR鑒定，Ct感染18例，Ng感染2例，Mg感染2例，Tv感染4例。此外，在這216例無癥狀人群中復合感染11例。以上結果表明如果醫(yī)生僅根據患者的癥狀進行經驗性治療的話，有可能導致治療失敗。因此，立即進行多重檢測顯得有必要，因為對于多重感染患者而言，可使治療方案最佳化。相對上述4種病原體，Uu和Mh在STD以及非淋球菌性尿道炎(Nongonococcal urethritis，NGU）中的作用目前仍有爭議。盡管有報道稱Uu可以導致持續(xù)性NGU，但正常人的尿道經常可以分離出Uu。Mh目前也被認為是人體正常寄生菌，但是它在特定條件下（如免疫力低下）可以作為病原體致病[5-6]。通常，泌尿生殖道中Mh定植的概率，男性是4%～13%，女性是21%～54%[7]。本研究證實Mh的感染率男性為2.78%，女性11.57%，略低于報道，這可能與本研究人群的環(huán)境與飲食習慣有關。

本文結果顯示，Uu和Mh的感染率分別為17.59%和14.35%，但若合并Ct感染，其陽性率上升為27.8%和33.3%。其原因目前仍不清楚，Ct感染后引起的黏膜損傷可能更有利于Uu和Mh的定植。

在多重PCR的反應體系中，由于使用了多對引物，因此能一次性擴增多個目標序列，這為臨床醫(yī)生同時檢測許多臨床領域的病原微生物提供了方便。尤其是當臨床樣本量極少或難以多次獲取時，多重PCR可以利用單個的樣本得到更多的目的片段。Horii等[8]證實，相比普通PCR，多重PCR總體敏感性是96%，特異性是100%，且不存在其他微生物的交叉反應，特別是對于高危人群(如職業(yè)性工作者)、有多個性伴侶及免疫力低下人群。通過運用多重PCR，臨床醫(yī)生可以快速鑒定出多種微生物感染，并能對無癥狀人群及時治療，從而可以降低性傳播病原體的感染率。

[1]Falk L,Fredlund H,Jensen JS.Signs and symptoms of urethritis and cervicitis among women with or without Mycoplasma genitali?um or Chlamydia trachomatis infection[J].Sex Transm Infect,2005,81(1):73-78.

[2]Land JA,Van Bergen JE,Morre SA,et al.Epidemiology of Chlamydia trachomatis infection in women and the cost-effectiveness of screening[J].Hum Reprod Update,2010,16(2):189-204.

[3]Sethupathi M,Blackwell A.Chlamydia trachomatis infection:the efficacy and safety of a fast-track referral and treatment system[J].Int J STDAIDS,2009,20(3):184-187.

[4]Gdoura R,Kchaou W,Ammar-Keskes L,et al.Assessment of Chla?mydia trachomatis,Ureaplasma urealyticum,Ureaplasma parvum,Mycoplasma hominis,and Mycoplasma genitalium in semen and first void urine specimens of asymptomatic male partners of infertile couples[J].JAndrol,2008,29(2):198-206.

[5]Alados JC,Cobo F,Jiménez MD,et al.Catheter infection by Myco?plasma hominis in a patient with acute lymphoblastic leukemia[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,1998,16(5):252-261.

[6]Martin DH.Nongonococcal urethritis:new views through the prism of modern molecular microbiology[J].Curr Infect Dis Rep,2008,10(2):128-132.

[7]Kilic D,Basar MM,Kaygusuz S,et al.Prevalence and treatment of Chlamydia trachomatis,Ureaplasma urealyticum,and Mycoplasma hominis in patients with non-gonococcal urethritis[J].Jpn J Infect Dis,2004,57(1):17-20.

[8]Horii T,Ohtsuka H,Osaki M,et al.Use of a dual priming oligonucleotide system to detect multiple sexually transmitted pathogens in clinical specimens[J].LettAppl Microbiol,2009,49(5):46-52.