鉤吻素子無嗎啡樣藥物依賴性

許 盈，丘宏強，沈 潔，莊偉霞，莊家慶，鄭光渝，俞昌喜

鉤吻素子在多種實驗性疼痛模型上呈現顯著的抗慢性疼痛藥理作用，如慢性炎性疼痛、外周神經損傷所致的神經病理性疼痛，且治療指數大［1］，提示鉤吻素子有開發為臨床鎮痛藥的潛在價值。阿片類鎮痛藥是目前臨床應用的重要鎮痛藥，但限制這類藥物使用的最大障礙是藥物依賴性。鉤吻素子是否有產生嗎啡樣藥物依賴性的潛力有待研究。本研究在離體和整體動物水平考察鉤吻素子產生嗎啡樣身體依賴性和精神依賴性的潛力，為其新藥創制提供藥物依賴性方面的實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物 成年雄性豚鼠4只，體質量350～450g，清潔級［上海市松江區松聯實驗動物場，許可證號：SCXK（滬）2007－0011］。健康雄性ICR小鼠79只，體質量18～23g，清潔級［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2009－0005］。

1．1．2 藥品與試劑 鉤吻素子粉末，本課題組分離純化，純度達99．1%。鹽酸納洛酮（美國Sigma公司）；卡巴膽堿（批號：10082603，山東博士倫福瑞達制藥有限公司）；鹽酸嗎啡注射液（批號：041106，沈陽第一制藥廠）；其余試劑均為分析純。

1．1．3 儀器 多道生理信號采集處理系統（RM6240，成都儀器廠）；條件性位置偏愛儀（Dig－Behv－4CPPug，上海吉量軟件科技有限公司）；精密電子天平（ER－182A，日本AND會社）。

1．2 方法

1．2．1 離體豚鼠回腸藥物依賴模型 豚鼠回腸藥物依賴模型，參照文獻［2］改動建立：雄性豚鼠禁食12h、不禁水，擊頭處死，立即取回腸末端20cm，棄盲腸端5cm，置于Krebs液中，修剪回腸周圍脂肪組織及血管，用Krebs液洗凈腸內容物，剪切成長約2．0～3．0cm的標本，安置于37℃恒溫浴槽中，加Krebs液10mL，通氣（95%O2＋5%CO2），調前負荷1g，每10min換液1次，標本穩定后，用含嗎啡（終濃度為4μmol／L）或鉤吻素子等（見后實驗方案）的Krebs液孵育4h，建立豚鼠回腸標本藥物依賴模型，加入納洛酮（終濃度為4μmol／L）催促戒斷癥狀（特異性收縮），記錄納洛酮催促戒斷收縮張力。Krebs液洗脫藥物，穩定后，加入卡巴膽堿（終濃度為1μmol／L），記錄回腸肌最大收縮張力。按下式計算納洛酮催促戒斷收縮百分率：

1．2．2 身體依賴性試驗 身體依賴模型參照文獻［3］改動：皮下注射嗎啡（首日10mg／kg，逐日遞增10mg／kg）或鉤吻素子等（見后實驗方案），每天2次（9∶00，17∶00），連續7d，建立小鼠對藥物的身體依賴。

催促戒斷反應：第8d上午皮下注射嗎啡（80mg／kg）或鉤吻素子等（見后實驗方案），2h后腹腔注射鹽酸納洛酮（6mg／kg），隨即放入高35cm，直徑為30cm的玻璃缸中，觀察給予納洛酮后20min內小鼠的跳躍次數和納洛酮給藥前后1h的體質量下降量。

自然戒斷反應：第8d繼續給予小鼠嗎啡（80mg／kg）或鉤吻素子等（見后實驗方案），未施加納絡酮；第9d起停止給予嗎啡，測定從給藥首日到停藥后6d小鼠的體質量變化。

1．2．3 精神依賴性試驗 精神依賴性試驗采用的是條件性位置偏愛實驗，參照文獻［4］改動，由預測試、訓練和測試三個階段組成。預測試階段（第1～3d），黑白箱連通，讓小鼠自由探索整個箱體15min，每天1次，連續3d。記錄小鼠第2～3d在黑、白箱的平均停留時間。預測試結果顯示小鼠在黑箱中停留時間大于在白箱中的停留時間，規定訓練階段以小鼠非偏愛側白箱作為伴藥箱。訓練階段（第4～9d）：黑白箱隔斷訓練，其中第4，6，8d小鼠皮下注射干預藥物后，隨即置于伴藥箱白箱中訓練30min；第5，7，9d小鼠皮下注射生理鹽水后，隨即置于非伴藥箱黑箱中訓練30min。測試階段（第10d），將小鼠放入抽掉隔板的偏愛箱中間位置，觀測15min，記錄小鼠在伴藥箱白箱的停留時間。

1．2．4 實驗方案

1．2．4．1 鉤吻素子離體豚鼠回腸嗎啡樣戒斷癥狀的觀察 豚鼠回腸標本隨機分3組：嗎啡組、鉤吻素子組和對照組，分別用含嗎啡（終濃度為4μmol／L）、鉤吻素子（終濃度100μmol／L）和不含藥物的Krebs液孵育4h，建立豚鼠回腸藥物依賴模型，測定納洛酮催促戒斷收縮張力和標本最大收縮張力，計算納洛酮催促戒斷收縮百分率，離體水平觀察鉤吻素子是否具有嗎啡樣戒斷癥狀。

1．2．4．2 鉤吻素子小鼠嗎啡樣身體依賴戒斷癥狀的觀察 催促戒斷癥狀：小鼠隨機分為嗎啡組、鉤吻素子組和對照組，每組8只。嗎啡組按上述方案給予嗎啡，鉤吻素子組和對照組則分別皮下注射鉤吻素子（10mg／kg）和等體積生理鹽水，第8d上午給藥2h后，觀測納洛酮催促小鼠戒斷跳躍次數以及體質量變化。自然戒斷癥狀：未施加納洛酮，組別設計同催促戒斷癥狀，觀測實驗過程小鼠體質量變化。

1．2．4．3 鉤吻素子小鼠嗎啡樣精神依賴的條件性位置偏愛效應的觀察 小鼠隨機分為嗎啡組、鉤吻素子組和對照組，每組10只。按上述方案進行預測試、訓練和測試。訓練階段各組干預藥物：嗎啡組為6mg／kg嗎啡，鉤吻素子組為10mg／kg鉤吻素子，對照組為等體積生理鹽水。測定小鼠在伴藥箱中的停留時間，判斷鉤吻素子是否具有嗎啡精神依賴樣的條件性位置偏愛效應。

1．3 統計學處理 采用SPSS 11．5版本統計軟件。跳躍次數數據以中位數（第一四分位數～第三四分位數）［M（Q1～Q3）］表示，組間差別采用Kruskal－Wallis秩和檢驗，組內兩兩比較采用Mann－Whitney檢驗。其他數據以±s表示，組間差別采用單因素方差分析，若方差齊性，組內兩兩比較采用LSD檢驗；若方差不齊，組內兩兩比較采用Dunnett T3檢驗。

2 結 果

2．1 鉤吻素子離體豚鼠回腸嗎啡樣戒斷反應觀察納洛酮催促戒斷收縮反應百分率經單因素方差分析顯示，組間差別有統計學意義（F＝17．209，P＜0．01）。對照組豚鼠回腸標本不出現收縮或僅引起較小幅度不規則收縮，納洛酮催促戒斷收縮百分率僅為（3．6±4．7）%；嗎啡組則促發戒斷癥狀，即特異性收縮反應：迅速出現大幅度的強直性收縮，維持1～2min逐漸恢復至正常水平，納洛酮催促戒斷收縮百分率（34．2±13．0）%，遠高于對照組，差別具有統計學意義（P＜0．01）；鉤吻素子組則出現小幅度收縮，納洛酮催促戒斷收縮百分率（10．4±4．1）%，低于嗎啡組，差別具有統計學意義（P＜0．01），略高于對照組，但差別無統計學意義（P＝0．873）。

2．2 鉤吻素子小鼠嗎啡樣身體依賴戒斷反應的觀察

2．2．1 鉤吻素子小鼠嗎啡樣身體依賴催促戒斷反應的觀察 嗎啡組給予嗎啡后出現豎尾、跑動增加的興奮活動。鉤吻素子組和對照組未出現類似活動。納洛酮催促戒斷后，嗎啡組出現腹瀉、跳躍、前爪震顫和“濕狗”樣抖動等明顯的戒斷癥狀；對照組和鉤吻素子組未見上述表現。經測定，納洛酮催促戒斷跳躍次數和體質量下降量見表1。Kruskal－Wallis秩和檢驗顯示跳躍次數組間差別具有統計學意義（χ2＝15．472，P＜0．01），單因素方差分析顯示體質量下降量的組間差別具有統計學意義（F＝8．026，P＜0．01）。組內兩兩比較顯示，嗎啡組跳躍次數和體質量下降量顯著高于對照組，差別均具有統計學意義（P＜0．01）；鉤吻素子組腹腔注射納洛酮后，跳躍次數和體質量下降量顯著低于嗎啡組，差別均具有統計學意義（P＜0．01），但與對照組比較，差別均無統計學意義（P＝0．144和P＝0．406）。

表1 鉤吻素子誘導小鼠嗎啡樣身體依賴催促戒斷癥狀的潛力Tab 1 Potential of inducing mouse morpine－like physical dependence precipitated withdrawal symptoms in mice by Koumine

2．2．2 鉤吻素子小鼠嗎啡樣身體依賴性自然戒斷癥狀的觀察 對照組體質量逐日遞增；與對照組比較，嗎啡組在給予嗎啡1d后體質量增長慢，給予嗎啡2d后體質量顯著下降（P＜0．01），給予嗎啡3d后體質量開始恢復，但均低于對照組；其中第3～6d差別具有統計學意義（P＜0．01），第7d開始明顯恢復；但第10d體質量再次顯著降低（P＜0．01），隨后體質量有所增長，但始終低于對照組，差別具有統計學意義（P＜0．01）（圖1）。實驗過程鉤吻素子組小鼠體質量變化趨勢同對照組，差別無統計學意義（P＞0．05）。嗎啡停用后，嗎啡組出現不安、“濕狗”樣抖動等自然戒斷癥狀；鉤吻素子組在鉤吻素子停藥前后，行為學無顯著改變。

圖1 鉤吻素子誘導小鼠嗎啡樣身體依賴自然戒斷癥狀的潛力Fig 1 Potential of inducing natural morphinelike physical dependence withdrawal symptoms in mice by Koumine

2．3 鉤吻素子小鼠嗎啡樣精神依賴性條件性位置偏愛效應的觀察 預測試顯示小鼠黑箱停留時間略高于白箱，規定白箱為伴藥箱，單因素方差分析顯示組間白箱停留時間差別無統計學意義（F＝0．045，P＝0．957）。經訓練后，組間白箱停留時間差別有統計學意義（F＝5．055，P＜0．05），嗎啡組在伴藥箱的停留時間高于對照組，差別具有統計學意義（P＜0．01）；鉤吻素子組在伴藥箱停留時間低于嗎啡組，差別具有統計學意義（P＜0．05），與對照組比較，差別無統計學意義（P＝0．833）（圖2）。

圖2 鉤吻素子誘導小鼠嗎啡樣精神依賴性條件性位置偏愛效應的潛力Fig 2 Potential of Koumine inducing mouse morphine－like psychological dependence place preference in mice by Koumine

3 討 論

藥物依賴性是限制藥物（特別是鎮痛藥）臨床應用的重要原因之一。前期研究提示，鉤吻素子具有潛在治療慢性疼痛的臨床應用價值［1］。慢性疼痛需要長期用藥，鉤吻素子是否具有自身依賴性亟需考察。本研究就鉤吻素子是否具有嗎啡樣藥物依賴性（包括身體依賴和精神依賴）進行評價。

首先在離體水平采用經典的豚鼠回腸實驗初步評價鉤吻素子的嗎啡樣身體依賴性潛力。嗎啡孵育豚鼠回腸標本出現特征性納洛酮催促戒斷收縮反應，同文獻報道［2，5］，提示嗎啡依賴豚鼠回腸模型建立成功。以往多數文獻采用“納洛酮戒斷收縮張力”為指標評價藥物是否具有身體依賴性潛力，但該指標未考慮到標本本身的收縮性能差異以及儀器各通道敏感性差別。為消除這些因素的影響，本研究選用“納洛酮催促戒斷收縮反應百分率”為指標定量評價鉤吻素子的身體依賴性潛力。結果發現，在25倍于嗎啡濃度的鉤吻素子孵育豚鼠回腸標本中，納洛酮催促收縮反應百分率雖增高但差別無顯著性，提示鉤吻素子不具有誘導豚鼠回腸表達嗎啡樣戒斷反應的潛力。

隨后在整體動物水平采用經典的催促戒斷和自然戒斷實驗進一步觀察鉤吻素子的身體依賴性潛力。前期研究表明，2～10mg／kg鉤吻素子具有顯著抗炎性疼痛的作用，因而本研究在整體動物水平選擇高劑量10mg／kg作為鉤吻素子自身依賴性潛力評價的給藥劑量。

催促戒斷實驗發現，嗎啡組納洛酮催促后很快出現多而紛亂的自發活動、重復的刻板式跳躍、排便、體質量下降等典型戒斷反應，同文獻報道一致［5］；以最為明顯且客觀的跳躍反應次數和體質量下降量為指標定量評價鉤吻素子誘導嗎啡身體依賴樣催促戒斷癥狀的潛力，結果表明，納洛酮催促后，嗎啡組小鼠跳躍反應次數顯著增加、體質量下降量明顯，與文獻報道一致［5－6］，提示成功誘導嗎啡身體依賴樣催促戒斷癥狀。鉤吻素子組未見類似現象，提示鉤吻素子不具有誘導小鼠產生嗎啡樣身體依賴催促戒斷癥狀的潛力。

由于自然戒斷實驗的戒斷體征和行為變化出現晚，持續時間長，定量觀察比較困難，但嗎啡身體依賴致小鼠體質量下降是較為客觀的［5］，因此以體質量變化為指標定量評價鉤吻素子誘導嗎啡身體依賴樣自然戒斷癥狀的潛力。本研究觀察到給予嗎啡2d后，小鼠體質量即顯著降低，推測嗎啡可能引起小鼠急性生理功能紊亂而致體質量急劇下降，而后體質量逐漸恢復，特別是用藥5d后，推測小鼠可能對嗎啡產生適應性變化；嗎啡停用后小鼠增質量減緩，與文獻報道一致［5－6］，提示成功誘導嗎啡身體依賴樣自然戒斷癥狀。而鉤吻素子組未見類似變化，提示鉤吻素子不具有誘導小鼠產生嗎啡樣身體依賴自然戒斷癥狀的潛力。

綜合豚鼠回腸實驗、催促戒斷和自然戒斷實驗結果提示，鉤吻素子可能無產生嗎啡樣身體依賴性的潛力。

進而采用經典的條件性位置偏愛試驗評價鉤吻素子的嗎啡樣精神依賴性潛力。小鼠經嗎啡和非偏愛箱（白箱）的伴藥訓練后，小鼠增加白箱的停留時間，與文獻報道結果一致［4－5］，提示條件性位置偏愛模型成功建立；在此基礎上評價鉤吻素子的精神依賴性，結果初步顯示鉤吻素子并不產生嗎啡精神依賴樣條件性位置偏愛效應。由于阿片類藥物的精神依賴性是導致藥物濫用的最主要因素，鉤吻素子不具有嗎啡樣精神依賴性，因此可能不易出現藥物濫用現象，從而有利于其開發成臨床藥物后的廣泛使用。鉤吻素子無嗎啡樣精神依賴性是否具有種屬差別，有待在更多層次的動物模型以及臨床試驗上進一步驗證。

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