鉤吻素子抗外周神經損傷致神經病理性疼痛中自發痛的效應

李蘇平，許 盈，凌 倩，洪志紅，劉 銘，楊 漸，俞昌喜

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）系慢性疼痛，其主要癥狀包括自發性疼痛（簡稱“自發痛”）、痛覺超敏和痛覺過敏，臨床發生率分別為100%，64%和38%。3種疼痛癥狀中，自發痛發生率最高，被認為是反映患者疼痛“平均水平”和“最嚴重狀態”的較理想的指標［1－2］。鉤吻素子（Koumine，分子式C20H22N2O，相對分子質量306．3），屬吲哚類生物堿（圖1），是我國歷史悠久的藥用植物鉤吻（GelsemiumelegansBenth．）的主要有效成分之一，具有抗慢性疼痛的作用［3］。為探討鉤吻素子對NPP中自發痛是否有效，本研究在外周神經損傷致NPP模型上，觀察鉤吻素子抗NPP中自發痛效應，為鉤吻素子新藥創制提供藥效學的實驗依據。

1 動物與方法

1．1 動物 雄性SD大鼠97只，體質量130～150g，清潔級［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007－0005］。實驗前適應性飼養7d，光暗周期12／12h（光照時間8∶00～20∶00）下恒溫（23±2）℃、恒濕度（50±5）%環境飼養，自由飲水飲食。所有針對大鼠的實驗操作都遵守國際和本地實驗動物使用和保護委員會頒布的條例。

圖1 鉤吻素子結構式Fig 1 Chemical structure of Koumine

1．2 方法

1．2．1 藥品與試劑 鉤吻素子粉末為本課題組分離純化，純度達99．1%。其余試劑均為國產分析純。

1．2．2 大鼠坐骨神經慢性束縛損傷（chronic constriction injury，CCI）所致NPP模型的建立 參照文獻［4］建立大鼠CCI模型：水合氯醛麻醉大鼠，暴露大鼠右后肢的坐骨神經，4－0鉻制羊腸線環繞坐骨神經干做4個輕度結扎環，單結固定，間距1mm，結扎松緊程度以右后肢輕微的顫動為宜。假手術（Sham）組動物僅暴露坐骨神經并進行穿線操作但不實施結扎。

1．2．3 自發痛的測定 參照文獻［5－6］稍作修改后，進行自發性疼痛行為觀察與行為學評分。將大鼠置于透明有機玻璃盒（26cm×13cm×16cm，底部由網狀鐵絲構成），適應5min后，記錄大鼠術側足5min內自發性抬足時間（動物理毛或走動引起的抬足時間不計在內），觀察術側足姿勢并進行評分。實驗過程出現術側足自噬而無法觀測的動物淘汰。自發痛測定采用雙盲設計。

1．2．4 實驗方案

1．2．4．1 單次給予鉤吻素子方案 大鼠隨機分為Sham＋生理鹽水（saline）組，Sham＋鉤吻素子高劑量（7．0mg／kg）組，CCI＋saline組，CCI＋鉤吻素子高、中、低劑量（7．0，1．4，0．28mg／kg）組。測基礎自發性抬足時間和足姿勢評分；大鼠行坐骨神經CCI術或Sham術（記為第0d，下同），術后第3d測給藥前自發性抬足時間和足姿勢評分，隨后大鼠皮下注射鉤吻素子（7．0，1．4，0．28mg／kg）或生理鹽水，給藥體積為4mL／kg，1h后測給藥后自發性抬足時間和足姿勢行為學評分。

1．2．4．2 連續給予鉤吻素子方案 大鼠隨機分為Sham＋saline組、CCI＋saline組、CCI＋鉤吻素子（7．0，0．28mg／kg）2個劑量組。測基礎自發性抬足時間和足姿勢評分；大鼠行坐骨神經CCI術或Sham術，術后第3d測給藥前自發性抬足時間和足姿勢評分，隨后大鼠皮下注射鉤吻素子（7．0，0．28 mg／kg）或生理鹽水，給藥體積為4mL／kg，連續給藥7d，每天2次，在術后第3，5，7，9d上午給藥1h后測大鼠給藥后自發性抬足時間和足姿勢評分。

1．3 評分標準 0分：術側足自然放于地面，無可見的異常情況；1分：術側足輕觸地面，但足趾并攏；2分：術側足輕觸地面，足趾并攏并且拱起；3分：術側足僅足跟或內側緣著地；4分：術側足后翻，自發抬足。

1．4 統計學處理 數據以中位數（第一四分位數～第三四分位數）［M（Q1～Q3）］表示，統計處理由SPSS 11．5版統計軟件完成。組間差異采用Kruskal－Wallis秩和檢驗，組內兩兩比較采用Mann－Whitney檢驗。

2 結 果

2．1 單次給予鉤吻素子對CCI大鼠自發痛的效應

2．1．1 自發性抬足 術前大鼠均未見自發性抬足。Sham大鼠在實驗期間未見術側自發性抬足；術后CCI大鼠術側足自發性抬足時間高于Sham大鼠（P＜0．01）；CCI大鼠單次皮下注射給予溶劑生理鹽水后自發性抬足時間與給藥前比無顯著變化（P＝0．597），但CCI大鼠單次皮下注射給予高、中、低劑量鉤吻素子后，減少自發性抬足時間，作用呈劑量依賴性（P＜0．01），其中高劑量組與溶劑對照組比，差別有統計學意義（P＜0．01）。術側足自發性抬足時間見表1。

表1 單次皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側自發性抬足時間的影響Tab 1 Effect of acute subcutaneous administration of Koumine on spontaneous foot－lifting time in rats with CCI neuropathy

2．1．2 術側足姿勢 術前動物評分均為0。Sham大鼠評分在實驗過程均為0。CCI大鼠給藥前評分增加，動物100%為4分；CCI大鼠單次皮下注射給予溶劑生理鹽水后，足姿勢評分與給藥前比，無明顯改變（P＝0．317），但CCI大鼠單次皮下注射給予高、中、低劑量鉤吻素子后，足姿勢評分降低，呈劑量依賴性，其中高、中劑量評分中位數均已降至2分，差別有統計學意義（P＜0．01，P＜0．05），尤其高劑量組足姿勢評分構成比以2分為主，甚至出現1分的評分。術側足姿勢評分見表2和圖2。

2．2 連續給予鉤吻素子對CCI大鼠自發痛的效應

2．2．1 自發性抬足 術前大鼠均未見自發性抬足，Sham大鼠在實驗過程亦未見；CCI大鼠在術后第3d自發性抬足時間顯著升高（P＜0．01），CCI＋saline組在隨后1周都維持較高水平。鉤吻素子處理組較之CCI＋saline組自發性抬足時間有所減少，隨劑量增加，減少越明顯。高劑量組在術后第3，5，7，9d自發性抬足時間均低于CCI＋saline組，差別有統計學意義（P＜0．01）。各組術側足自發性抬足時間見表3。

2．2．2 術側足姿勢 術前動物評分構成比100%為0，即均為正常狀態，Sham大鼠評分在實驗過程亦構成比100%為0；術后第3d，CCI大鼠評分增加，出現2～4分的評分，其中4分的構成比超過50%，CCI＋saline組在隨后1周評分都維持較高水平，其中4分的構成比約占77%以上。鉤吻素子處理組較之CCI＋saline組姿勢評分有所降低，隨劑量增加，降低越明顯；隨療程的推移，療效有增強的趨勢。高劑量組在術后第3，5，7，9d評分均低于CCI＋saline組，差別有統計學意義（P＜0．05或P＜0．01），到術后第9d療效最強，中位數為2分，構成比中4分比重已降至10%以下，改善為2～3分為主，并出現1分的評分。各組術側足姿勢評分見表4和圖3。

表2 單次皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側足姿勢評分的影響Tab 2 Effect of acute subcutaneous administration of Koumine on paw postural index in rats with CCI neuropathy

表3 連續皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側自發性抬足時間的影響Tab 3 Effect of repeated subcutaneous administration of Koumine on spontaneous foot－lifting time in rats with CCI neuropathy

表4 連續皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側足姿勢評分的影響Tab 4 Effect of repeated subcutaneous administration of Koumine on paw postural index in rats with CCI neuropathy

3 討 論

圖2 單次皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側足姿勢評分構成比的影響Fig 2 Effect of acute administration of Koumine on CCI－induced foot deformity in terms of postural index

圖3 連續皮下注射給予鉤吻素子對CCI大鼠術側足姿勢評分構成比的影響Fig 3 Effect of repeated administration of Koumine on CCI－induced foot deformity in terms of postural index

自發痛是NPP的重要組成之一，但由于自發痛具有強烈的主觀性，不易測定，因而在研發NPP的鎮痛藥物過程中往往很少見到文獻報道藥物對自發痛的藥效評價［1－2］，大多是針對易于定量評價的誘發痛進行，并基于對誘發痛的有效性即報道該藥可能有良好的臨床應用價值，但很多藥物進入臨床后卻未見良效，可能原因之一是其忽視了對自發痛的評價，不能很好地模擬臨床癥狀，從而得出假陽性的結果。盡管自發痛具有主觀性，但多年來也研發出多種自發痛的測定方法，并不斷改進完善，如自發性疼痛行為學測定法、條件偏愛實驗法、承重減輕評價法、大小鼠面部表情評分法等［5－9］。其中，自發痛行為學測定法是最經典且易于普通實驗室開展的。

自發痛行為學測定法通常包括足姿勢評分和自發性抬足時間測定。足姿勢評分是Attal于1990年根據福爾馬林試驗改進建立的自發痛評分方法（0～5分），隨后有不同實驗室對評分標準進行了改良，如最后一級評分“舔術側足”后來被認為是很少見的，因而隨后評分等級改為0～4分，并成為普遍采用的評分等級［5，8，10］。但具體0～4分標準的定義還是有所差別，如第3分的評分標準：Attal等為“術側足僅后跟著地且后翻”［5］，而Kupers等為“僅內側緣著地”［10］；筆者在預實驗過程發現這兩種情況并不常見，而且在同一只動物上并不一定同時出現。又如Kupers等在足趾形態上分級更細，選用不同標準可能評出的自發痛等級可能不同［10］，因此，本研究對二者的評分作了綜合改進，以期更客觀評價自發痛。預實驗還發現若觀察箱采用玻璃底面，動物的排泄物干擾觀察，不易觀察到后翻、僅內側緣或足后跟著地的現象，相鄰評分等級有時不易界定；后改用網格底面，排泄物的干擾減少，上述自發痛現象更容易觀察且界定更清晰。Attal等發現自發痛在動物CCI術后第1～2d即可出現［5］。為了初步判斷鉤吻素子是否有抗NPP中自發痛的作用，本研究選擇了術后第3d進行初篩。術后第3d，Sham大鼠未見明顯自發性抬足和足姿勢改變，提示Sham術本身對動物無顯著影響；CCI大鼠出現明顯足姿勢改變、自發性抬足次數增多（抬足時間中位數為4．8s），而且CCI大鼠的自發痛是很持久的，在術后第3～9d足姿勢評分和自發性抬足時間均維持較高水平，與文獻報道一致［5－6］，提示 NPP自發痛模型建立成功。

本研究在自發痛模型基礎上評價鉤吻素子的抗自發痛作用，發現單次給予鉤吻素子可劑量依賴性降低CCI大鼠自發性抬足時間和改善足姿勢評分，而對Sham大鼠無影響，提示單次給予鉤吻素子可能具有抗自發痛的作用。進而采用連續給予的給藥方案進一步觀察，發現鉤吻素子高劑量有確切的逆轉足姿勢評分和自發性抬足時間的作用，進一步提示鉤吻素子具有抗自發性疼痛的作用。與對照組比較，給予鉤吻素子的大鼠在實驗過程未見明顯的鎮靜作用，大鼠的自主活動與其他組比，無明顯差別，提示鉤吻素子對大鼠自發痛的治療作用不屬于非選擇性的鎮靜作用。

筆者認為，鉤吻素子具有抗實驗性NPP中自發痛的作用，預期該結果可以為鉤吻素子研發為新型鎮痛藥提供藥效學依據。

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［1］ Backonja M M，Stacey B．Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating［J］．JPain，2004，5（9）：491－497．

［2］ 李蘇平，俞昌喜．神經病理性疼痛自發痛動物模型的研究進展［J］．中華行為醫學與腦科學雜志，2013，22（4）：377－379．

［3］ Xu Y，Qiu H Q，Liu H，etal．Effects of koumine，an alkaloid ofGelsemiumelegansBenth．，on inflammatory and neuropathic pain models and possible mechanism with allopregnanolone［J］．PharmacolBiochemBehav，2012，101（3）：504－514．

［4］ Bennett G J，Xie Y K．A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］．Pain，1988，33（1）：87－107．

［5］ Attal N，Jazat F，Kayser V，etal．Further evidence for＇pain－related＇behaviours in a model of unilateral peripheral mononeuropathy［J］．Pain，1990，41（2）：235－251．

［6］ Choi Y，Yoon Y W，Na H S，etal．Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain［J］．Pain，1994，59（3）：369－376．

［7］ King T，Vera－Portocarrero L，Gutierrez T，etal．Unmasking the tonic－aversive state in neuropathic pain［J］．NatNeurosci，2009，12（11）：1364－1366．

［8］ Nakazato－Imasato E，Kurebayashi Y．Pharmacological characteristics of the hind paw weight bearing difference induced by chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats［J］．Life Sci，2009，84（17－18）：622－626．

［9］ Langford D J，Bailey A L，Chanda M L，etal．Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse［J］．NatMethods，2010，7（6）：447－449．

［10］ Kupers R，Yu W，Persson J K，etal．Photochemically－induced ischemia of the rat sciatic nerve produces a dose－dependent and highly reproducible mechanical，heat and cold allodynia，and signs of spontaneous pain［J］．Pain，1998，76（1－2）：45－59．