鉤吻素子的基本理化性質(zhì)及其水溶液穩(wěn)定性

蘇燕評(píng)，石冬梅，范振東，廖凱君，俞昌喜

鉤吻素子為馬錢科植物鉤吻（GelsemiumelegansBenth．）所提取的生物堿單體中含量最高的一種有效成分，分子式C20H22N2O，相對(duì)分子質(zhì)量為306．3［1］。本課題組先期工作采用高速逆流色譜技術(shù)從本地盛產(chǎn)的鉤吻中分離純化獲得鉤吻素子單體，分離周期短，得率高，純度達(dá)99%以上［2］；研究發(fā)現(xiàn)鉤吻素子具有顯著的抗慢性疼痛作用、抗焦慮作用，且其有效劑量遠(yuǎn)離LD50［3－6］；鉤吻素子能劑量依賴性地降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗體產(chǎn)生，改善其腫脹、痛敏、關(guān)節(jié)炎指數(shù)等癥狀，逆轉(zhuǎn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)病理性改變，提示鉤吻素子具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用［7］?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者認(rèn)為鉤吻植物中的活性成分鉤吻素子具有創(chuàng)制新型藥物的重大潛能，其劑型亟待研究。藥物理化性質(zhì)是藥物制劑設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，本研究擬探討鉤吻素子的基本理化性質(zhì)及其水溶液穩(wěn)定性，將為后續(xù)藥物劑型的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 試劑 鉤吻素子對(duì)照品為本課題組前期提取分離精制而成，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）鑒定，純度為99．1%；甲醇（色譜純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、正辛醇（均為分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑）。

1．1．2 儀器 高效液相色譜儀（Angilent 1100型，美國(guó) Angilent公司）；磁力攪拌器（ZNCL－S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；精密電子天平（ER－182A型，日本AND株會(huì)社）；精密酸度計(jì)（pHS－407型，上海大普儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL－16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；恒溫振蕩器（SHZ－82型，常州國(guó)華電器有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 鉤吻素子含量高效液相色譜測(cè)定法

1．2．1．1 HPLC條件 依利特 Hypersil ODS2高效液相色譜柱（5μm，4．6mm×250mm），柱溫25℃，流動(dòng)相：甲醇－0．2%正丁胺水溶液（58∶42），檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相流速：1．0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)：256nm。

1．2．1．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 以甲醇配制濃度分別為5．2，10．4，20．8，41．6，83．2和166．4μg／mL 的鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液，按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，以鉤吻素子濃度Y（μg／mL）對(duì)峰面積X進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y＝9．526 2X－11．106

鉤吻素子甲醇溶液在5．2～166．4μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＝0．999 9。

1．2．1．3 方法學(xué)考察 配制濃度為20．2μg／mL的鉤吻素子甲醇溶液，以上述HPLC法進(jìn)樣分析，顯示甲醇溶液對(duì)鉤吻素子的測(cè)定無干擾，該方法專屬 性 良 好；分 別 配 制 濃 度 為10．4，41．6和166．4μg／mL的鉤吻素子甲醇溶液，以上述 HPLC法進(jìn)樣分析，重復(fù)性試驗(yàn)顯示高、中、低3個(gè)濃度的峰面積 RSD均＜3%，分別為0．97%，0．46%和0．53%，該法重復(fù)性良好（n＝5）；精密度試驗(yàn)顯示日內(nèi) RSD均＜3%，分別為2．7%，2．1%和0．8%，回收率分別為99．8%，100．5%和102．5%，日間RSD均＜5%，分別為4．07%，3．48%和1．02%，該法精密度良好，回收率符合測(cè)定要求（n＝5）。

1．2．2 平衡溶解度測(cè)定法 分別配制pH為1．0的 HCl溶液和pH 為2．5，5．0，6．8，7．4和8．0的PBS緩沖液。取過量的鉤吻素子原料藥于具塞試管內(nèi)，分別加入上述溶液及純凈水、甲醇、乙醇各1mL，超聲溶解20min后放入恒溫震蕩器于25℃下震蕩48h，100次／min，分別在6，12，24和48h取少量上層澄清液離心3min，10 000r／min，取上層溶液10μL，用甲醇稀釋后HPLC法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鉤吻素子的含量。依據(jù)2010版中國(guó)藥典關(guān)于溶解度的描述，判斷鉤吻素子在上述溶液中的溶解性能［8］。

1．2．3 表觀油／水分配系數(shù)測(cè)定法 分別配制pH為1．0和3．0的 HCl溶液，pH 為6．8和7．4的PBS緩沖液，pH為9．0的NaOH溶液。以正辛醇為油相，上述不同pH溶液為水相，將油相和水相等體積混合后置于分液漏斗中，振搖后放置過夜，分層，下層為正辛醇飽和的水層，上層為水飽和的正辛醇層。

取濃度為4．06mg／mL鉤吻素子溶液200μL，分別用上述下層溶液定容至2mL，得到濃度為406μg／mL的供試品溶液。分別精密移取各供試液1mL，加入上述上層溶液各1mL，渦旋少許后，置于恒溫振蕩器中于25℃下震蕩72h充分平衡，100次／min。待平衡后，分離出水層和正辛醇層，用甲醇稀釋10倍后HPLC法進(jìn)樣分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算油相鉤吻素子濃度C1和水相鉤吻素子濃度C2，按下述公式計(jì)算鉤吻素子的表觀油／水分配分配系數(shù)P：并計(jì)算其對(duì)數(shù)值LgP［9］。

1．2．4 鉤吻素子水溶液穩(wěn)定性測(cè)定法 分別配制pH 為3．0，5．0，7．0，8．0的PBS溶液，精密移取濃度為2．7mg／mL鉤吻素子母液200μL于5mL容量瓶中，分別用上述緩沖液定容至刻度，4，25，37℃下分別存放，于第0，2，5，15，25d各取樣1次，HPLC法測(cè)定其含量，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鉤吻素子濃度。以第0天測(cè)得的濃度為C0，其他時(shí)間點(diǎn)測(cè)得濃度為Ct，剩余百分率Cr＝Ct／C0［10－11］。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，Cr為縱坐標(biāo)作圖，考察鉤吻素子含量變化。

2 結(jié) 果

2．1 鉤吻素子的平衡溶解度 鉤吻素子在不同介質(zhì)中的平衡溶解度見表1，鉤吻素子微溶于乙醇，溶解于甲醇，易溶于pH 2．5～8．0的PBS緩沖液和純水；鉤吻素子溶解度與溶液pH值相關(guān)，堿性條件下溶解度降低。

表1 鉤吻素子在不同介質(zhì)中的平衡溶解度（25℃）Tab 1 The solubility of Koumine in different medium at 25℃

2．2 鉤吻素子的的表觀油／水分配系數(shù) 鉤吻素子的表觀油／水分配系數(shù)在酸性和堿性條件中存在明顯差異，酸性條件下表觀油／水分配系數(shù)對(duì)數(shù)值LgP＜－1，鉤吻素子在水相分配較多；在中性和堿性環(huán)境中LgP＞1，鉤吻素子在油相分配較多。鉤吻素子在堿性條件下親脂性比酸性條件下高（表2）。

表2 鉤吻素子在不同pH溶液中的表觀油／水分配系數(shù)Tab 2 Partition coefficient of Koumine between oil and water phase with different pH

2．3 鉤吻素子水溶液的穩(wěn)定性 4℃和25℃時(shí)，不同pH 條件下（3，5，7，9）的鉤吻素子水溶液放置25d后，鉤吻素子的含量均在94．58%（Ct／C0）以上，鉤素子水溶液在上述條件下穩(wěn)定性良好；37℃時(shí)，pH 5，7或9條件下放置25d鉤吻素子的含量≥97%，但在強(qiáng)酸（pH3）條件下放置5d，藥物含量為原含量的94．85%，放置25d后為89．04%，在此條件下鉤吻素子穩(wěn)定性較差（圖1）。

圖1 不同pH鉤吻素子水溶液在4℃，25℃和37℃下的穩(wěn)定性Fig 1 Stability of Koumine in aqueous buffers at 4℃，25℃and 37℃

3 討 論

鉤吻素子屬于單萜吲哚類生物堿，生物堿在不同溶劑中的溶解性能與結(jié)構(gòu)中的N原子的存在、分子的大小、結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)的種類和數(shù)目等因素有關(guān)［12］。平衡溶解度測(cè)定結(jié)果表明鉤吻素子微溶于乙醇，溶解于甲醇，易溶于純水、pH為1．0的HCl溶液和pH為2．5～8．0的PBS溶液中，為一中等極性水溶性生物堿，且溶解度與溶液pH值相關(guān)，堿性條件下鉤吻素子溶解度降低。因此，在后續(xù)的鉤吻素子緩釋劑型研究中可選用符合水溶性藥物特性的親水凝膠骨架材料羥丙甲基纖維素；而在其緩釋片釋放度實(shí)驗(yàn)中，可采用pH 6．8磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，此時(shí)鉤吻素子釋放符合漏槽條件。

表觀油／水分配系數(shù)影響藥物的透膜吸收，而藥物的脂溶性大小是影響藥物透膜吸收的重要因素之一［13］。一般而言，LgP較小的藥物吸收較差，LgP＞1的藥物吸收較好。鉤吻素子進(jìn)入胃部（酸性條件）后與胃酸生成生物堿鹽，呈離子狀態(tài)，此時(shí)分配系數(shù)?。↙gP＜－1），在胃部吸收較少，生物堿鹽進(jìn)入小腸（堿性環(huán)境）后，還原成高濃度分子型游離堿，此時(shí)鉤吻素子分配系數(shù)大（LgP＞1），親脂性高，藥物跨過生物膜吸收入體內(nèi)。通過鉤吻素子表觀油／水分配系數(shù)的測(cè)定推斷其主要吸收部位可能是小腸。

水溶液穩(wěn)定性考察表明，在4℃和25℃時(shí)，不同pH（3，5，7，9）條件下鉤吻素子水溶液穩(wěn)定性均良好；在37℃時(shí)，鉤吻素子水溶液在強(qiáng)酸（pH 3）條件下穩(wěn)定性較差，因此鉤吻素子的酸性水溶液要避免高溫儲(chǔ)存。

藥物理化性質(zhì)研究是藥物制劑設(shè)計(jì)的基本環(huán)節(jié)，在此基礎(chǔ)上才能有目的地選擇適宜的劑型、輔料、制劑技術(shù)或工藝。本研究首次對(duì)鉤吻素子平衡溶解度、表觀油／水分配系數(shù)和水溶液穩(wěn)定性等與口服緩釋固體制劑密切相關(guān)的理化性質(zhì)進(jìn)行考察，為后續(xù)鉤吻素子的劑型研究奠定基礎(chǔ)。

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