內皮型一氧化氮合酶基因多態性與突發性耳聾關系的研究＊

樊 軍，張曉進，石 磊

（1.天津港口醫院耳鼻咽喉科，天津 300456；2.新疆醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗中心，新疆烏魯木齊 830054；3.天津公安醫院耳鼻喉科，天津 300040）

突發性耳聾（sudden sensorineural hearing loss，SSHL）是一種突然發生的原因不明的感音神經性聽力損失性疾病。一氧化氮是一種具有廣泛生物活性的小分子化合物，可作為介質、信使或細胞功能調節因子參與體內一系列生理和病理過程，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是一氧化氮合成的限速酶，調節一氧化氮的合成，對一氧化氮生物功能的發揮起著非常重要的作用［1］。近年來，人們已證明了一氧化氮對耳蝸神經的毒性作用，在SSHL的發病過程中，一氧化氮的神經毒性作用占首位。內皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）基因存在多態性［2］，eNOS基因第4內含子的27bp可變數目串聯重復序列（variable number of tandem repeats，VNTR）插入／缺失多態性（4b／a）是決定血管壁一氧化氮基礎水平最重要的基因位點。本文探討了SSHL患者eNOS基因4b／a多態性的分布、頻率及其與SSHL的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年3月至2010年3月天津港口醫院和天津公安醫院的耳鼻咽喉科門診的SSHL患者150例。按是否有合并癥將患者分為合并癥組（患者合并糖尿病、心血管疾病或脂代謝疾?。┘盁o合并癥組（患者無合并癥）。合并癥組78例，男44例，女34例；無合并癥組72例，男40例，女32例。入選患者年齡30～70歲，平均（51.81±8.12）歲；發病至治療時間為2d～3個月。選擇同期無SSHL、糖尿病、心血管疾病或脂代謝疾病的52例健康人作為對照組，男31例，女21例；年齡30～70歲，平均（52.22±7.41）歲。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：Tripure分離液（美國Sigma公司）、DNA提取試劑盒（美國Promega公司）、PCR反應試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。主要儀器：PE-480型熱循環儀（美國Perkin Elmer Cetus公司）、凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）、紫外透射分析儀（美國UVP公司）。

1.3 標本采集 各組人員在采血前禁食12h，次日清晨抽空腹肘正中靜脈血2mL，分離出的血清置于-20℃儲存備用。

1.4 基因檢測

1.4.1 基因組DNA的提取 采用Tripure分離液及DNA提取試劑盒抽提患者血清DNA；（2）PCR擴增目的基因片斷，引物序列：上游5′-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TT-3′，下游5′-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3′［3］。PCR擴增條件：94℃預變性3min，92℃變性30s，58.5℃退火1min，72℃延伸45s，擴增35個循環；72℃延伸7min。

1.4.2 基因型的確定 產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下確定其基因型。

1.5 統計學處理 采用SPSS10.0軟件包進行統計學分析，計量資料用表示，基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，兩樣本均數的比較采用t檢驗，多個樣本均數的比較采用方差分析和q檢驗。基因型和等位基因的相對危險度以比值比（odds ratio，OR）及95%可信區間（confidence interval，CI）表示，采用非條件Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因型分析 無合并癥組患者血清中沒有擴增出4a／a基因型，而對照組和合并癥組患者的基因型中涵蓋4a／a、4b／b、和4b／a 3種基因型，見圖1。

圖1 eNOS基因第4內含子基因型分布的電泳圖

2.2 eNOS基因第4內含子與SSHL的關系 合并癥組患者的3種基因型分布與無合并癥組比較，差異有統計學意義（χ2=3.55，P＜0.05）。無合并癥組、合并癥組患者的3種基因型分布分別與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=3.65，P＜0.05；χ2=6.44，P＜0.05）。合并癥組患者的2種等位基因（4b、4a）與無合并癥組比較，差異有統計學意義（χ2=2.99，P＜0.05）。合并癥組患者的4b／b、4b／a、4a／a基因型所占比例分別為48.85%（64／131）、66.67%（10／15）、100.00%（4／4），4b和4a等位基因合并癥的患病率分別為50.71%（71／140）和70.00%（7／10），二者的OR（4b／4a）為4.02，95%CI為1.48～7.65（P＜0.05）。以上結果表明eNOS 4a等位基因是SSHL患者發生合并癥的危險因素，見表1。

表1 各組eNOS基因第4內含子基因型及等位基因的分布和頻率

3 討 論

eNOS基因第4內含子的27bp VNTR多態性是由于重復次數不同形成3種等位基因而產生，其中，重復4次為等位基因a，重復5次為等位基因b，他們是決定一氧化氮基礎水平最重要的基因位點［4］。目前，在耳科領域有關一氧化氮的研究取得了很大的成果。一氧化氮除了作用于內皮外平滑肌細胞使血管擴張外，還能抑制血管內血小板的凝集，這2個功能有助于維持耳蝸持續的血液灌注［5］。一氧化氮是在NOS的作用下由體內L-精氨酸轉化而來，一氧化氮通過鳥苷酸環化酶中鐵原子的作用，激活鳥苷酸環化酶，使細胞內鳥苷酸環化酶含量升高，血管平滑肌舒張［6］。一氧化氮在內耳的血液循環中也發揮重要作用，它產生于血管的內皮細胞和平滑肌細胞，并調節前庭、耳蝸的血流［7］。在SSHL發病過程中，一氧化氮的神經毒性作用占首位［8］。eNOS基因第4內含子的27bp VNTR多態性是決定一氧化氮基礎水平的關鍵基因位點［9-10］，故筆者提出eNOS基因第4內含子的27bp VNTR多態性可能作為診斷SSHL的候選基因。

本課題在研究eNOS基因第4內含子基因型及等位基因的分布和頻率中發現，帶a等位基因比不帶a等位基因的SSHL患者的合并癥患病率高，可見eNOS 4a等位基因是SSHL患者發生合并癥的危險因素。eNOS基因第4內含子的27bp VNTR多態性是決定血管壁一氧化氮基礎水平最重要的基因位點。

總之，eNOS基因與SSHL的關系研究為臨床診療SSHL提供了新思路，為進一步闡明SSHL的病因奠定了基礎。

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