基于液相色譜-質譜技術的高尿酸血癥血漿代謝組學研究

馬文峰，馬志剛，王萬山，周 婭，俞守義

（1.廣東省衛生廳干部保健局，廣東廣州 510000；2.甘肅省人民醫院腎內科，甘肅蘭州 730000；3.南方醫科大學比較醫學研究所，廣東廣州 510515；4.廣州軍區聯勤部衛生部，廣東廣州 510063）

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學后出現的以定性和定量描述生物體內多種代謝物動態變化為目的的新興組學，是系統生物學的重要組成部分。質譜分析和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是該領域內2種關鍵的實驗技術，其中液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用技術集高效液相色譜高分離性能與質譜的高靈敏度、高特異性的優點于一體，逐漸成為代謝組學研究的主流技術。當前臨床和流行病學領域已有大量代謝組學的實際應用，用于探索各種疾病的復雜的分子機制。評價各種代謝途徑的大量代謝物（如底物、中間產物以及終端產物）的技術更是廣泛用于糖尿病、心血管疾病代謝狀態的危險評估中［1-3］。高尿酸血癥作為世界范圍內一般人群中患病率較高的代謝性疾病在當前并未引起足夠重視，其與糖尿病、腎病及代謝綜合征等代謝性疾病之間具有錯綜復雜的相互作用［4］，代謝組學研究將為揭示高尿酸血癥的發病機制、危險因素及其與相關代謝性疾病的發生、發展提供了一個獨特視角。

1 材料與方法

1.1 病例來源 收集單純高尿酸血癥男性患者14例，將其作為高尿酸血癥組，年齡20～40歲；無背景疾病，如感染，高血脂，高血壓，高血糖及肝、腎疾病等；診斷參照中華醫學會風濕病學分會定義標準［5］。收集健康成年男性10例作為對照組。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器包括：ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統（美國）、Xevo G2QTof四極桿飛行時間串聯質譜儀（美國）；Aquity UPLCTM C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）、低溫高速離心機（德國Beckman公司）、超聲清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）；GR-202AND電子分析天平（日本）、熱電超低溫冰箱（美國Thermo Scientific Forma ULT）、華凌BD-42冰箱。主要試劑：大黃素（批號：30269），購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自美國Merck公司；純水由反滲透超純水儀（GT-30L，上海飛域實驗室設備有限公司）制備。

1.3 采樣和血漿分離 受檢者早餐前空腹于上肢靜脈處采血5mL，血樣收集于真空肝素抗凝的采血管內，靜置10min后4℃1 000×g冷凍離心10min，取離心后的上清液，于-80℃冷凍儲存。

1.4 樣品處理 取200μL血漿樣品至1.5mL的Eppendorf管中，加20μL內標溶液（含10μg／mL大黃素），再加800μL甲醇-乙腈（1∶1，V／V），渦流混合1min，震蕩均勻，然后14 000×g離心30min后，取10μL上清液進樣。

1.5 分析條件 采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography-quatrupole-time-offlight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術分析高尿酸血癥患者和健康者血漿代謝物圖譜。

1.5.1 色譜條件 Aquity UPLCTM C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流速0.6mL／min，柱溫35℃，流動相 A為0.1%FA-H2O，流動相B為0.1%FA-CAN，進樣體積0.2L。梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質譜條件 采用Xevo G2QTof四極桿飛行時間串聯質譜儀，離子化模式：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）（＋），毛細管電壓3kV，Sampling Cone 30V，Extraction Cone 4.0V，源溫度120℃，霧化氣溫度550℃，霧化氣流速800L／h，錐孔氣流速50L／h。

1.6 統計學處理 采用MarkerLynx XS軟件對原始數據進行校正和歸一化處理，對處理后的數據應用SIMCA-P＋12.0.1（瑞典Umctries公司）統計學軟件對樣品進行分組并采用正交信號校正和偏最小二乘法判別分析（orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis，OSC-PLSDA）分析。分析結果以二維和三維得分圖（scores plot）和載荷圖（loadings plot）的形式表示，考察健康志愿者組和高尿酸血癥患者組的樣品差異性及獲取差異信息。組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血漿代謝物譜圖OSC-PLS-DA結果 應用SIMCA-P＋12.0.1軟件對MarkerLynx XS導出數據進行OSC-PLS-DA分析，繪制出得分圖（圖1、2）、載荷圖（圖3）和S-plot圖（圖4）。由圖1、2可知，高尿酸血癥組與對照組分別具有一定的聚類作用，在二維空間得分圖中高尿酸血癥組和對照組受檢者的血漿代謝譜中各自成長條狀集中分布，且兩組無交叉重疊，明顯分開，提示兩組之間血漿中小分子代謝物的組成具有差異，OSC-PLS-DA方法可以將兩組樣本較好地分開。并且二維得分圖和三維得分圖具有很好的一致性。從圖3可知，絕大多數點集中在原點附近，只有少數點遠離原點。這些遠離原點的點實際上就是將高尿酸血癥組與對照組患者的血漿樣品完全區分開的關鍵代謝物，也就是說這些代謝物是在高尿酸血癥患病血漿內發生顯著變化的關鍵化合物。紅框為高尿酸血癥組與對照組之間潛在的差異代謝標志物。由圖4可看出S-plot的兩端是潛在的差異代謝標志物。

圖1 OSC-PLS-DA分析的二維得分圖

圖2 OSC-PLS-DA分析的三維得分圖

圖3 OSC-PLS-DA分析的載荷圖

2.2 潛在標記物的發現 在OSC濾噪的PLS-DA模型中VIP（very important in projection）值大于1的變量被看作可能的潛在標記物，通過S-plot圖對它們的可靠性進行驗證，將和分類相關性低的變量剔除，剩余的變量再進行t檢驗，P＜0.05的變量視為高尿酸血癥患者與健康人區分的潛在標記物。經過多種多變量分析手段的結合，最終共有6種質荷比大小的代謝物被認為是區分高尿酸血癥患者與健康人的潛在標記物，見表2。經過搜索 HMDB （http：／／www.Hmdb.ca／）數據庫及KEGG （http：／／www.genome.jp／）數據庫，同時參照有關文獻，結果發現油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、反油酸、異油酸、Pristanal、三甲基十三烷酸、癸烯酸、8-異構前列腺素、Postin、3-葡萄糖苷酸孕二醇、腸抑素、吡啶等近20種物質是高尿酸血癥潛在的生物標志物，主要包括脂肪酸和短肽等，準確的結構確認和含量測定有待于二級質譜掃描和利用標準物質進行進一步的對照和計算。

表2 兩組間的差異代謝標記物

圖4 OSC-PLS-DA分析的S-plot圖

3 討 論

與傳統組學相比，代謝組學有自身的優點［6］。首先是最接近表型，基因和蛋白表達的變化最終以落腳于代謝過程產生終端效應。因此，代謝組學研究是反映生物體系表型和遺傳型之間聯系的紐帶，對了解生物體病理生理和新陳代謝的本質具有重要的作用。其次，基因和蛋白表達的有效的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易。另外，因為代謝產物在各個生物體系中都是類似的，可以尋找到針對某種代謝物或者一類代謝物的分析方法，而不用考慮物種的區別［7］，因此，代謝組學研究中采用的技術更為通用；而且代謝物的種類要遠小于基因和蛋白的數目，便于分析。

目前國內關于利用代謝組學進行高尿酸血癥研究的僅見1篇報道，鐘麟等［8］等利用氫NMR代謝組學方法分析高尿酸血癥患者和健康對照者血漿中飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、極低密度脂蛋白等代謝物的變化，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和PLS，分析這些目標代謝物的表達差異。結果發現與健康對照組比較，高尿酸血癥組患者的飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、極低密度脂蛋白、乳酸、乙醇的水平上升，卵磷脂、谷氨酰胺、葡萄糖的水平下降。從而認為高尿酸血癥患者相較于健康對照組受檢者存在更多脂類代謝異常、糖酵解加劇、谷氨酰胺水平下降等問題，并指出該類物質可能與高尿酸血癥的發病、轉歸和預后有關。由此也提示高尿酸血癥患者血脂、血糖代謝亦出現異常，從分子機制上證明尿酸水平與血脂、血糖等質譜分析組分是有關聯的。該研究中同時也發現高尿酸血癥患者發生了類似心血管疾病進程中的脂類代謝改變，提示高尿酸血癥與心血管疾病的關聯。

本研究結果提示脂肪酸代謝異常可能是高尿酸血癥發病牽涉的代謝途徑之一：棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸等脂肪酸主要參與脂肪酸的合成、脂肪酸在線粒體的伸長、脂肪酸代謝以及不飽和脂肪酸的合成等生化反應過程，這些物質在高尿酸血癥患者血漿中的升高提示高尿酸血癥患者脂肪酸代謝可能發生紊亂。有研究表明硬脂酸、亞油酸、油酸等可作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）的代謝產物譜。飽和脂肪酸攝入過多是導致高胰島素血癥的危險因素，尤其是棕櫚酸（C16∶0），可促使2型糖尿病的發生。脂肪酸引起血壓升高和促進高血壓血管病變與血漿游離脂肪酸的組成有關，血漿游離脂肪酸對血管內皮細胞有直接作用，在脂肪酸中，損害血管內皮的脂肪酸有硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、軟脂酸（C16∶0）等。最新研究表明，高尿酸血癥與冠心病、糖尿病、高血壓等有密切的相互作用，這在脂質代謝紊亂中得到集中體現。

本研究還發現高尿酸血癥患者Pristanal水平可能升高，Pristanal是植烷酸和降植烷酸之間的中間代謝產物，植烷酸和降植烷酸水平升高與過氧化物酶體失調有關，此時，由于缺乏功能性過氧化物酶體而導致植烷酸降解障礙。植烷酸水平升高常與多種代謝紊亂的發生相關，在多種代謝性疾病發生中發揮重要作用。此外，研究結果提示高尿酸血癥患者Postin和腸抑素水平可能下降，Postin是胱蛋白酶抑制劑C的N末端四肽，是促吞噬肽激活劑，而促吞噬肽與免疫系統功能相關。腸抑素是脂肪消化時釋放自胰輔酯酶的五肽，主要存在于近端小腸，是選擇性食欲抑制劑，尤其是針對脂肪攝入。女性肥胖者血漿腸抑素水平常常升高，飽食之后其分泌減少。

Liu等［9］采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器技術檢測和鑒定了痛風患者血清和尿液中的新生物標志物，即血清中的尿酸、肌酐、色氨酸和尿液中的尿酸、肌酐、鳥嘌呤核苷及馬尿酸。通過對標志物在痛風不同時期的對比發現，與間歇期痛風比較，急性痛風期患者嘌呤、蛋白質以及葡萄糖代謝異常更為顯著，急性期由于鳥苷代謝的原因促使血清尿酸水平升高。研究結果對痛風代謝機制的闡明很有幫助，這對本研究的進一步開展以及確定高尿酸血癥患者血漿潛在的生物標志物具有借鑒意義。

總之，本研究應用超高效液相色譜技術，結合高分辨率質譜，達到了區分高尿酸血癥患者與健康人血漿小分子代謝物的目的，并發現了部分差異代謝標志物。由于時間的原因，本研究沒有進行差異代謝標志物的鑒定。在下一步工作中將對這些目標化合物進行跟蹤并獲得其二級質譜結構信息，必要時結合標準品對照，對其結構進行鑒定和確認，這將有助于揭示高尿酸血癥的發病機制及其代謝特征，為其預測和防治奠定基礎。

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