白藜蘆醇抑制胰島素樣生長因子1促乳腺癌細胞增殖及其機制的研究＊

郭慧琳，張獻全

（重慶醫科大學附屬第二醫院腫瘤科，重慶 400010）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，盡管化療和內分泌療法已普遍應用于乳腺癌的治療，并顯示出一定效果，但是有相當部分的患者治療后復發轉移［1］。因此，尋求預防和治療乳腺癌復發轉移的有效低毒藥物具有重要意義。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）與乳腺癌的發生、發展密切相關，IGF-1通過自分泌和旁分泌方式在乳腺癌的發病中發揮重要作用，靶向抑制IGF-1的促腫瘤細胞增殖效應可提高對乳腺癌細胞的殺傷作用［2］。白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄、虎杖等多種植物中的非黃酮類多酚化合物。研究發現白藜蘆醇對多種惡性腫瘤細胞具有顯著的抑制作用［3］。但是，白藜蘆醇能否抑制IGF-1的促乳腺癌的增殖效應并不清楚。本研究將人乳腺癌MCF-7細胞作為研究對象，觀察白藜蘆醇對IGF-1促乳腺癌細胞增殖的抑制效應，并探討其抑制IGF-1作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細胞株 DMEM干粉培養基購自美國Hy-Clone公司；磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（serine／threonine protein kinases，AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）抗體均為兔抗多克隆抗體，購自美國Cell Signaling公司；PI3K抑制劑——Wortmannin購自美國Sigma公司；SuperSignal化學發光試劑盒購自美國Pierce公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）為北京中衫金橋生物技術有限公司產品。人乳腺癌MCF-7細胞株購自中科院上海生化細胞研究所。

1.2 細胞培養 將MCF-7細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃，含有95%空氣和5%CO2的培養箱中常規培養。待細胞長至融合狀態時以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 細胞增殖實驗 將細胞制成單細胞懸液，計數后將細胞密度調整為1×104／mL，接種于96孔培養板，培養24h，細胞貼壁后換為無血清培養基培養4h，分別用不同濃度IGF-1（10、20、40ng／mL）或白藜蘆醇（10、25、50μmol／L）作用 MCF-7細胞48h，然后每孔加入20μL MTT（5mg／mL）溶液，置培養箱中繼續培養4h，吸棄上清液終止培養，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，于振蕩器上搖勻10min，在490nm波長處測各孔細胞的吸光度值。以不用藥物處理的細胞作為對照。

1.4 免疫印跡實驗 藥物作用后的MCF-7細胞經常規方法提取蛋白，考馬斯亮藍法測定細胞提取物的蛋白質濃度。加入上樣緩沖液，沸水浴5min，取等量總蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），采用半干轉移法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。室溫下用5%脫脂奶粉封閉3h，然后將膜與抗PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT抗體（1∶400稀釋）作用，4℃孵育過夜；用含吐溫-20的Tris緩沖液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次；加入羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1h；TBST洗膜3次，采用Super-Signal化學發光試劑盒顯色發光。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，兩組以上的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IGF-1對MCF-7細胞的促增殖效應 IGF-1作用48h后，MCF-7細胞增殖明顯，隨著IGF-1作用濃度的不斷增加，其對MCF-7細胞增殖的促進效應不斷增強（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度IGF-1對MCF-7細胞增殖的影響

2.2 白藜蘆醇對MCF-7細胞增殖的抑制效應 白藜蘆醇對MCF-7細胞具有一定的增殖抑制作用，隨著白藜蘆醇作用濃度的增加，其對MCF-7細胞的抑制效應逐漸增強（P＜0.05），見圖2。

2.3 白藜蘆醇對IGF-1促MCF-7細胞增殖的抑制效應 白藜蘆醇（10、25、50μmol／L）與IGF-1（40ng／mL）共同作用MCF-7細胞48h后，MCF-7細胞增殖明顯降低，并呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖3。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對MCF-7細胞增殖的影響

圖3 白藜蘆醇對IGF-1促MCF-7細胞增殖的抑制效應

2.4 PI3K-AKT信號途徑在IGF-1介導的促MCF-7細胞增殖中的作用 為了明確PI3K-AKT信號途徑在IGF-1介導的促MCF-7細胞增殖中的作用，利用PI3K抑制劑Wortmannin與IGF-1共作用MCF-7細胞48h。結果顯示經Wortmannin（10-6mol／L）預處理后，IGF-1（40ng／mL）對 MCF-7細胞的促增殖效應受到明顯抑制（P＜0.05），見圖4，提示PI3K-AKT信號途徑在IGF-1介導的促MCF-7細胞增殖效應中發揮了重要作用。

圖4 Wortmannin對IGF-1促MCF-7細胞增殖效應的影響

2.5 白藜蘆醇對IGF-1促增殖信號的抑制作用 為了探討白藜蘆醇抑制IGF-1促MCF-7細胞增殖的分子機制，采用免疫印跡法檢測白藜蘆醇對IGF-1促增殖信號的影響。結果發現，IGF-1（40ng／mL）作用30min后，p-PI3K與p-AKT蛋白的表達水平明顯提高（P＜0.05），但對總PI3K與AKT蛋白表達沒有影響（P＞0.05）。以白藜蘆醇（50μmol／L）、IGF-1（40ng／mL）共同作用MCF-7細胞后，細胞中p-PI3K與p-AKT蛋白表達水平明顯低于IGF-1組（P＜0.05），見圖5、6。上述結果提示白藜蘆醇抑制IGF-1促MCF-7細胞增殖效應與其抑制IGF-1激活的PI3K-AKT信號途徑密切相關。

圖5 白藜蘆醇（50μmol／L）對IGF-1誘導p-PI3K表達的影響

圖6 白藜蘆醇（50μmol／L）對IGF-1誘導p-AKT表達的影響

3 討 論

IGF-1是促進細胞增殖、分化與血管形成等生物學效應的多肽生長因子。IGF-1與其受體結合后，具有促進腫瘤細胞增殖，誘導細胞向惡性表型轉化，抑制腫瘤細胞凋亡等作用，與多種惡性腫瘤的發生、發展、轉移密切相關［4］。IGF-1以內分泌、自分泌和旁分泌方式作用于靶器官，局部合成和分泌的IGF-1可能與血液循環中的IGF-1共同對局部組織發揮作用。來自12個國家的7個前瞻性研究數據顯示，血液循環中IGF-1水平與乳腺癌的危險性密切相關，乳腺癌組織中IGF-1的表達水平可作為獨立預后因素［5-6］。而且，IGF-1受體基因的表達與原發性乳腺癌的預后具有密切關聯，特異性抑制IGF-1受體可以降低乳腺癌細胞的增殖［7-8］。以上研究提示IGF-1在乳腺癌的發展、發展中具有重要作用，如何有效抑制其促腫瘤細胞的增殖效應具有重要意義。

近年來，白藜蘆醇的抗腫瘤活性受到廣泛重視。研究發現白藜蘆醇對肺癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤具有顯著抑制作用［9-10］。其中，白藜蘆醇對乳腺癌的多種生物學作用引起人們的關注。研究表明白藜蘆醇在多種乳腺癌細胞中具有抑制增殖效應。Sareen等［11］在體外實驗中證實白藜蘆醇能有效降低乳腺癌移植瘤的大小。白藜蘆醇通過半胱-天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）依賴或非依賴的方式誘導乳腺癌細胞凋亡；通過抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達而降低乳腺癌細胞的遷徙；還可以明顯增強環磷酰胺、雷帕霉素等藥物的抗腫瘤作用［12-14］。Levi等［15］證實白藜蘆醇與乳腺癌發病率呈負相關。但是，白藜蘆醇作為重要的腫瘤細胞抑制劑，是否對IGF-1的促乳腺癌細胞增殖效應具有抑制作用并不清楚。本研究以乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，觀察白藜蘆醇對IGF-1促乳腺癌細胞增殖是否具有抑制效應。結果發現，IGF-1促MCF-7細胞的增殖作用明顯，而白藜蘆醇能明顯抑制IGF-1的促MCF-7細胞增殖效應。與白藜蘆醇單獨作用抑制MCF-7細胞的增殖效應比較，白藜蘆醇與IGF-1共同作用對MCF-7細胞的抑制作用更為顯著。

PI3K-AKT信號途徑在乳腺癌細胞增殖過程中發揮了重要作用。雌激素通過雌激素受體依賴的PI3K-AKT信號途徑促進乳腺癌細胞的增殖；PI3K-AKT途徑導致Bcl-2轉錄與表達增強，促進了乳腺癌細胞的生存；PI3K活性過高可導致乳腺癌細胞對內分泌治療的抵抗或逃逸［16-17］。近年來的研究還發現PI3K-AKT的下游激酶也在雌激素受體介導的乳腺癌細胞生存中扮演了重要角色［18］。而且，PI3K-AKT信號途徑在IGF-1等諸多因素促腫瘤細胞增殖中扮演了重要角色［19］。本研究發現利用PI3K抑制劑Wortmannin能夠有效抑制IGF-1的促MCF-7細胞增殖作用，提示PI3K-AKT信號途徑參與了IGF-1的促MCF-7細胞增殖過程。有報道指出白藜蘆醇通過PI3K-AKT信號途徑抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲［13］。本研究通過免疫印跡檢測發現，IGF-1能夠顯著提高MCF-7細胞p-PI3K與p-AKT蛋白的表達水平，提示其激活MCF-7細胞的PI3K-AKT信號途徑。進一步研究發現白藜蘆醇能夠顯著降低IGF-1促p-PI3K與p-AKT蛋白表達的作用，提示白藜蘆醇抑制IGF-1促MCF-7細胞增殖與其抑制IGF-1激活PI3KAKT信號途徑有關。

綜上所述，白藜蘆醇對IGF-1介導的乳腺癌細胞增殖具有明顯抑制作用，在一定程度上能夠遏制IGF-1的促瘤效應，其抑制IGF-1促乳腺癌細胞增殖效應與抑制PI3K-AKT信號途徑有關。對白藜蘆醇進一步深入研究將對其在乳腺癌治療的臨床應用具有重要意義。

［1］Mego M，Mani SA，Cristofanilli M.Molecular mechanisms of metastasis in breast cancer——clinical applications［J］.Nat Rev Clin Oncol，2010，7（12）：693-701.

［2］Walsh LA，Damjanovski S.IGF-1increases invasive potential of MCF 7breast cancer cells and induces activation of latent TGF-β1resulting in epithelial to mesenchymal transition［J］.Cell Commun Signal，2011，9（1）：10.

［3］Shukla Y，Singh R.Resveratrol and cellular mechanisms of cancer prevention［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1215：1-8.

［4］Alberobello AT，D′esposito V，Marasco D，et al.Selective disruption of insulin-like growth factor-1（IGF-1）signaling via phosphoinositide-dependent kinase-1prevents the protective effect of IGF-1on human cancer cell death［J］.J Biol Chem，2010，285（9）：6563-6572.

［5］Endogenous H，Breast CA.Insulin-like growth factor 1（IGF1），IGF binding protein 3 （IGFBP3），and breast cancer risk：pooled individual data analysis of 17prospective studies［J］.Lancet Oncol，2010，11（6）：530-542.

［6］Chong KY，Subramanian A，Mokbel K，et al.The prognostic significance of the insulin-like growth factor-1 ligand and receptor expression in breast cancer tissue［J］.Surg Oncol，2011，104（3）：228-235.

［7］Fu P，Ibusuki M，Yamamoto Y，et al.Insulin-like growth factor-1receptor gene expression is associated with survival in breast cancer：a comprehensive analysis of gene copy number，mRNA and protein expression［J］.Breast cancer Res Treat，2011，130（1）：307-317.

［8］Mukohara T，Shimada H，Ogasawara N，et al.Sensitivity of breast cancer cell lines to the novel insulin-like growth factor-1receptor（IGF-1R）inhibitor NVP-AEW541is dependent on the level of IRS-1expression［J］.Cancer Lett，2009，282（1）：14-24.

［9］Miki H，Uehara N，Kimura A，et al.Resveratrol induces apoptosis via ROS-triggered autophagy in human colon cancer cells［J］.Int J Oncol，2012，40（4）：1020-1028.

［10］Bae S，Lee EM，Cha HJ，et al.Resveratrol alters microRNA expression profiles in A549human non-small cell lung cancer cells［J］.Mol Cells，2011，32（3）：243-249.

［11］Sareen D，Darjatmoko SR，Albert DM，et al.Mitochondria，Calcium，and calpain are key mediators of resveratrol-induced apoptosis in breast cancer［J］.Mol Pharmacol，2007，72（6）：1466-1475.

［12］Alkhalaf M，El-Mowafy A，Renno W，et al.Resveratrolinduced apoptosis in human breast Cancer cells is media-ted primarily through the caspase-3-dependent pathway［J］.Arch Med Res，2008，39（2）：162-168.

［13］Tang FY，Yc S，Chen NC，et al.Resveratrol inhibits migration and invasion of human breast-cancer cells［J］.Mol Nutr Food Res，2008，52（6）：683-691.

［14］Singh N，Nigam M，Ranjan V，et al.Resveratrol as an adjunct therapy in cyclophosphamide-treated MCF-7cells and breast tumor explants［J］.Cancer Sci，2011，102（5）：1059-1067.

［15］Levi F，Pasche C，Lucchini F，et al.Resveratrol and breast Cancer risk［J］.Eur J Cancer Prev，2005，14（2）：139-142.

［16］Bratton MR，Duong BN，Elliott S，et al.Regulation of ER-alpha-mediated transcription of Bcl-2by PI3K-AKT crosstalk：implications for breast Cancer cell survival［J］.Int J Oncol，2010，37（3）：541-550.

［17］Miller TW，Hennessy BT，González-Angulo AM，et al.Hyperactivation of phosphatidylinositol-3kinase promotes escape from hormone dependence in estrogen receptor-positive human breast cancer［J］.J Clin Invest，2010，120（7）：2406-2413.

［18］Wang Y，Zhou D，Phung S，et al.SGK3is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast Cancer cells［J］.Mol Endocrinol，2011，25（1）：72-82.

［19］Ma JC，Sawai H，Matsuo Y，et al.IGF-1mediates PTEN suppression and enhances cell invasion and proliferation via activation of the IGF-1／PI3K／AKT signaling pathway in pancreatic Cancer cells［J］.J Surg Res，2010，160（1）：90-101.