KLF4對人胃癌細胞株SGC-7901體外增殖及遷移侵襲能力的影響＊

黃 鎮，王子衛△，張 能，查 郎，吳 釗

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院胃腸外科，重慶 400016；2.四川大學華西第二醫院婦產科，四川成都 610041）

腫瘤是世界范圍內嚴重的公共衛生問題，在美國，每年有1／4的死亡由惡性腫瘤所致［1］，而作為最常見的上皮源性惡性腫瘤和主要的腫瘤致死性相關疾病，全球每年有12%的腫瘤患者死于胃癌［2］。雖然手術切除是胃癌治療的首選方案之一，特別是早中期胃癌［3］，然而，由于腫瘤細胞侵襲轉移，治療常常十分棘手。胃癌的侵襲轉移涉及一系列分子水平的異常，Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是近年來新發現的一種細胞生長抑制因子，參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種生理、病理過程的調控［4］。本課題組前期研究發現在胃癌組織中KLF4低表達，明顯低于癌旁及正常組織，并且其陽性表達與腫瘤浸潤層次和淋巴轉移相關［5］。本實驗選用人胃癌SGC-7901細胞株，轉染KLF4基因，進一步探討KLF4對胃癌細胞的生物學行為及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與質粒 人胃癌SGC-7901細胞株由重慶醫科大學附屬第一醫院實驗研究中心備存。pcDNA3.1-IRES-EGFP真核質粒載體購于北京泛基諾科技有限公司，pcDNA3.1IEKLF4重組真核質粒載體由北京泛基諾科技有限公司協助構建。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基、OPTI-MEMⅠ培養基、G418購于美國Gibco公司，新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于美國Sigma公司，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購于北京中杉金橋生物技術有限公司，胰蛋白酶和脂質體Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit、Premix Taq購于大連TaKaRa公司，DNA marker購于北京天根生化科技有限公司；Transwell小室（8μm孔徑）和人工基質膠Matrigel購于美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人胃癌SGC-7901細胞株呈貼壁生長，培養于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱。倒置光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。0.1%胰蛋白酶消化、收集細胞，按1∶2～4傳代。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3.2 構建真核表達載體pcDNA3.1IE-KLF4 pcDNA3.1-IRES-EGFP載體可表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），并具有對新霉素（neomycin）的抗藥基因，其產物可將G418轉化為無毒形式。pcDNA3.1IE-KLF4重組真核載體由北京泛基諾科技有限公司協助構建；將KLF4基因連接到上述載體的BamHⅠ／EcoRⅠ位點，對pcDNA3.1IE-KLF4最終載體行酶切和測序鑒定，證實構建成功。

1.3.3 脂質體介導轉染并建立KLF4穩定過表達細胞株將細胞分為未轉染組、pcDNA3.1-IRES-EGFP轉染組（即空載體組）、pcDNA3.1IE-KLF4轉染組（即轉染組）。轉染前1d，胰蛋白酶消化、收集細胞，接種于6孔板，每孔細胞2×105個，37℃、5%CO2培養至約60%匯合。每孔質粒（μg）與脂質體（μL）按1.0∶2.5配制轉染復合液，分別加入上述各組并輕輕混勻，OPTI-MEMⅠ培養基補足至2mL。6h后，更換為正常培養基繼續培養。24h后觀察轉染情況，成功轉染的細胞表達GFP，因而可被激發出綠色熒光，使細胞在熒光倒置顯微鏡下呈現為綠色。48h后，根據預實驗測定的最佳濃度行G418篩選（350μg／mL）。10～14d后，挑取單個克隆，以G418維持濃度（250μg／mL）擴大培養以獲得穩定轉染細胞株供后續實驗所用。

1.3.4 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測各實驗組KLF4mRNA的表達實驗分組同前。取各實驗組對數生長期細胞，按RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA，經紫外分光光度儀定量RNA濃度和純度，并逆轉錄合成cDNA。逆轉錄條件：37℃逆轉錄15min，85℃逆轉錄酶失活5s。擴增引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，序列如下：KLF4上游引物：5′-CTT CCT GCC CGA TCA GAT GC-3′，下游引 物：5′-CGG TAG TGC CTG GTC AGT TCA-3′，產物大小298bp；GAPDH 上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，產物大小476bp。擴增條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共循環30次。擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析儀觀察拍照，Quantity One軟件分析圖像。

1.3.5 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測各實驗組細胞增殖能力 胰蛋白酶法收集上述各實驗組對數生長期細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為2.5×104／mL，接種于96孔板（200μL／孔），每組設8個平行復孔。分別在接種后0、24、48、72h，每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL；常規培養4h后，棄上清液，加入DMSO（200μL／孔），振蕩10min使結晶物充分溶解。空白調零后，酶標儀檢測570nm波長處的吸光度（Absorbance，A）值。細胞增殖抑制率的計算公式：抑制率=（1-實驗組A570／對照組A570）×100%。

1.3.6 劃痕試驗檢測細胞遷移能力 按上述方法收集各組細胞接種于6孔板中（1×106／孔）。待細胞生長匯合成單層細胞后，用無菌的中號移液器槍頭在細胞層上小心地行“一”字形劃痕，PBS清洗2次，倒置顯微鏡下觀察劃痕處無懸浮或游離的細胞。分別在0、24、48h觀察并拍照各組劃痕愈合程度（反映細胞遷移能力），細胞遷移率的計算公式：遷移率=（1-48h劃痕距離／初始距離）×100%。

1.3.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 用無血清RPMI 1640培養基稀釋Matrigel基質膠至5mg／mL，取40μL加到Transwell小室膜上，37℃孵育使其凝固，紫外燈照射消毒過夜。實驗前加入30μL無血清RPMI 1640培養基水化基底膜（37℃，30min）。收集各實驗組細胞，用無血清RPMI 1640培養基調整細胞密度為5×105／mL，于上室中加入此細胞懸液400μL，下室中加入含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基600μL，常規培養。24h后，取出小室，用棉簽小心擦去上層細胞和基質膠，并用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠封片。每張片隨機選取5個視野進行細胞計數并拍照。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉染效率的測定 轉染24h后，熒光倒置顯微鏡觀察，成功轉染的細胞因表達GFP而被激發出綠色熒光，在鏡下呈現出綠色，見圖1。

2.2 轉染后各組細胞KLF4mRNA的表達 結果見圖2所示，在pcDNA3.1IE-KLF4轉染組中可見明顯擴增的KLF4基因片段，長度為298bp，而其他兩組中相應位置幾乎未見相應條帶或表達極低，因此，可以認為轉染成功，轉染組細胞中有KLF4mRNA的表達，見圖2。

2.3 MTT法測定各組細胞的生長增殖情況 MTT法檢測結果見表1。在各時間觀察點，未轉染組與空載體組細胞的A570值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。24h時，轉染組細胞A570值較對照組降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；在48h和72h，轉染組細胞A570值明顯低于未轉染組和空載體組（P＜0.05）。以對照組作為參照，24、48、72h轉染組的細胞增殖抑制率分別為12.90%、23.85%、25.56%。

圖1 轉染24h后的SGC-7901細胞（熒光倒置顯微鏡 ×200）

2.4 劃痕試驗檢測細胞體外遷移能力 劃痕48h后，未轉染組和空載體組細胞的遷移率分別為（78.15±4.86）%、（73.75±4.03）%，二者之間差異無統計學意義（P＞0.05）；轉染組細胞的遷移率為（60.84±5.56）%，較對照組下降（P＜0.05），見圖3。

2.5 Transwell小室檢測細胞體外侵襲能力 侵襲試驗結果顯示，未轉染組和空載體組的侵襲穿膜細胞數分別為（163.53±13.95）個、（158.07±12.54）個，組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；轉染組的侵襲穿膜細胞數為（73.87±8.70）個，較對照組明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖2 RT-PCR檢測各組細胞KLF4mRNA的表達

表1 不同時間點KLF4mRNA對SGC-7901細胞增殖的影響（，%，n=3）

表1 不同時間點KLF4mRNA對SGC-7901細胞增殖的影響（，%，n=3）

a：P＜0.05，與未轉染組比較；b：P＜0.05，與空載體組比較。

組別0h 24h 48h 72h未轉染組 0.283 6±0.283 6 0.377 2±0.077 5 0.468 0±0.098 40.528 7±0.080 4空載體組 0.285 0±0.057 4 0.385 1±0.069 8 0.459 4±0.064 7 0.513 1±0.067 6轉染組 0.287 5±0.062 0 0.312 9±0.103 0 0.353 1±0.057 6ab 0.387 7±0.029 0ab

圖3 劃痕試驗檢測KLF4對SGC-7901細胞遷移能力的影響（倒置顯微鏡×100）

3 討 論

胃腸道是一個開放的系統，其黏膜上皮一方面受到機械、化學以及生物因素等的侵襲而損傷脫落；另一方面，其上皮細胞通過增殖、分化、遷移以不斷更替，因此，胃腸道上皮處于損傷和抗損傷的動態平衡中。若此過程中某因素發生改變或調節失控，則可能導致正常細胞惡性轉化。作為最常見的腫瘤之一，胃癌的發病機制尚不明確，其發生、發展與多種因素相關。雖然已有手術、放療、化療等多種治療手段，但其治療常常因腫瘤細胞的侵襲轉移而失敗。KLF4是KLF家族中的重要成員之一，其羧基端的3個鋅指結構，為該家族特征性結構［6］。KLF4主要表達于胃腸道上皮、皮膚、血管內皮和胸腺，并且主要在上皮細胞分化末期、有絲分裂后期表達［7］，因此，也稱為胃腸富集KLF或上皮鋅指蛋白。人類KLF4基因位于9q31，有5個外顯子，其cDNA全長1 440bp，編碼產物為含有479個氨基酸殘基的蛋白。

KLF4與多種生命活動相關，包括生長、發育、增殖、分化等。研究表明，在胚胎發育晚期及腸管分化終末期的上皮細胞中KLF4表達均增高，在生長抑制的狀態下亦明顯增高，提示KLF4可抑制某些細胞的增殖，對調節上皮細胞分化有重要作用［8］。細胞的增殖依賴于細胞周期完整、有序地進行，而KLF4作為一種細胞生長抑制因子，一方面抑制Cyclin D1、鳥氨酸脫羧酶等細胞周期正性調節基因的啟動子，下調它們的表達；另一方面，KLF4還可誘導P21、P27、P53等細胞周期負調控因子表達，阻滯細胞G1期向S期轉化，從而抑制細胞增殖［9-10］。Ghaleb等［11］發現，有條件地敲出 KLF4基因后，缺陷小鼠小腸上皮細胞的增殖和遷移得到上調，并伴有腸絨毛刷狀緣分泌因子的改變和潘氏細胞異位；而在結腸，則伴有碳酸酐酶的減少和杯狀細胞的分化與成熟障礙。研究證實KLF4與多種腫瘤密切相關，其中膀胱癌、前列腺癌、食管癌、結直腸癌、胃癌等腫瘤中KLF4表達降低，而在乳腺導管癌和口腔鱗癌中KLF4表達上調。Xu等［12］研究發現，采用DNA去甲基化制劑5-氮-2′脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC）處理結腸癌SW620、RKO細胞系后，KLF4表達上調，提示KLF4在結直腸腺瘤和癌中的極度低表達可能與表觀遺傳學的調控有關，啟動子區異常甲基化降低了KLF4的表達。該研究還發現，雖然KLF4的表達情況與結直腸癌患者的總體預后無明顯關聯，但是對于已有淋巴結轉移的結直腸癌患者，KLF4陽性表達者的預后優于陰性表達者。

Wnt（wingless and int-1）／β-鏈蛋白（β-catenin）信號通路與正常組織發育和多種疾病的發生、發展密切相關，在腫瘤演變中亦起著極為重要的作用；該通路涉及β-catenin、結腸腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）因子、T細胞因子4（T cell factor 4，TCF-4）、淋巴增強因子（lymphoid enhancer factor，LEF）等參與，β-catenin是其中最重要的因子之一［13］。KLF4可直接與β-catenin轉錄活化區結合，下調β-catenin表達，并抑制其介導的轉錄［14］，提示 KLF4不僅是 Wnt／β-catenin信號通路中的重要成員，而且在此通路中發揮抑制作用。另外，KLF4還是一種干細胞相關因子，慢病毒介導聯合轉染八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct-4）、性別決定區Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX-2）、C-MYC及KLF4可誘導正常體細胞向多能干細胞轉化，進而發生增殖、分化、轉移的改變［15］。

侵襲轉移是惡性腫瘤的特性之一，亦是腫瘤惡性進展的關鍵步驟。在此過程中，腫瘤細胞無限增殖是前提，而腫瘤細胞同質黏附降低和異質黏附增強，使得腫瘤細胞更易脫落，并降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM），遷移至鄰近組織，進而發生遠處轉移。本研究以質粒為載體將KLF4基因成功轉入胃癌SGC-7901細胞，RT-PCR證實轉染細胞中KLF4 mRNA表達水平明顯提高。MTT顯示轉染KLF4基因后，細胞增殖下降，與此前另一研究方法結果一致［16］。劃痕試驗和Transwell小室試驗顯示轉染組細胞遷徙侵襲能力下降，其機制可能與 KLF4與β-catenin相互作用有關［14，17］，而β-catenin不僅是重要的細胞連接和黏附因子，亦是 Wnt／β-catenin信號通路中的核心成員之一。上皮細胞間質轉化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）參與了腫瘤侵襲轉移，沉默KLF4將會導致上皮細胞在形態和遷移方面發生變化，與此相伴的是上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）丟失，而KLF4表達上調后能明顯恢復E-cadherin的表達，同時抑制癌細胞的侵襲和轉移［18］。本研究顯示KLF4表達上調后，胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力發生改變，提示KLF4可能成為胃癌分子治療的潛在靶點，至于其中的機制，特別是KLF4與β-catenin、E-cadherin之間如何相互作用，是否還有其他因子參與，將會是筆者后續研究的重點。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

［2］Zheng L，Wang L，Ajani J，et al.Molecular basis of gastric Cancer development and progression［J］.Gastric Cancer，2004，7（2）：61-77.

［3］Leung WK，Wu MS，Kakugawa Y，et al.Screening for gastric Cancer in Asia：current evidence and practice［J］.Lancet Oncol，2008，9（3）：279-287.

［4］Flandez M，Guilmeau S，Blache P，et al.KLF4regulation in intestinal epithelial cell maturation［J］.Exp Cell Res，2008，314（20）：3712-3723.

［5］張能，查郎，黃鎮，等.E-cadherin和KLF4表達對胃癌侵襲轉移的作用［J］.生命科學研究，2011，15（2）：154-157.

［6］Kaczynski J，Cook T，Urrutia R.Sp1-and Krüppel-like transcription factors［J］.Genome Biol，2003，4（2）：206.

［7］Mcconnell BB，Ghaleb AM，Nandan MO，et al.The diverse functions of Krüppel-like factors 4and 5in epithelial biology and pathobiology［J］.Bioessays，2007，29（6）：549-557.

［8］Foster KW，Liu Z，Nail CD，et al.Induction of KLF4in basal keratinocytes blocks the proliferation-differentiation Switch and initiates squamous epithelial dysplasia［J］.Oncogene，2005，24（9）：1491-1500.

［9］Cai W，Chen X.Multimodality molecular imaging of tumor angiogenesis［J］.J Nucl Med，2008，49Suppl 2：S113-128.

［10］Nickenig G，Baudler S，Müller C，et al.Redox-sensitive vascular smooth muscle cell proliferation is mediated by GKLF and Id3in vitro and in vivo［J］.FASEB J，2002，16（9）：1077-1086.

［11］Ghaleb AM，McConnell BB，Kaestner KH，et al.Altered intestinal epithelial homeostasis in mice with intestinespecific deletion of the Krüppel-like factor 4gene［J］.Dev Biol，2011，349（2）：310-320.

［12］Xu J，LüB，Xu F，et al.Dynamic down-regulation of Krüppel-like factor 4in colorectal adenoma-carcinoma sequence［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（8）：891-898.

［13］Camilli TC，Weeraratna AT.Striking the target in Wnt-y conditions：intervening in Wnt signaling during Cancer progression［J］.Biochem Pharmacol，2010，80（5）：702-711.

［14］Zhang W，Chen X，Kato Y，et al.Novel cross talk of Kruppel-like factor 4and beta-catenin regulates normal intestinal homeostasis and tumor repression［J］.Mol Cell Biol，2006，26（6）：2055-2064.

［15］Liu Y，Zhang C，Fan J，et al.Comprehensive analysis of clinical significance of stem-cell related factors in renalcell cancer［J］.World J Surg Oncol，2011，9：121.

［16］黃鎮，王子衛，張能，等.KLF4對胃癌SGC-7901細胞株體外生長增殖的影響［J］.第三軍醫大學學報，2011，33（8）：822-825.

［17］Ghaleb AM，Mcconnell BB，Nandan MO，et al.Haploinsufficiency of krüppel-like factor 4promotes adenomatous polyposis coli dependent intestinal tumorigenesis［J］.Cancer Res，2007，67（15）：7147-7154.

［18］Yori JL，Johnson E，Zhou G，et al.Kruppel-like factor 4 inhibits epithelial-to-mesenchymal transition through regulation of E-cadherin gene expression ［J］.J Biol Chem，2010，285（22）：16854-16863.