AMPK激活對大鼠心肌細胞蛋白降解的影響＊

陳保林，陳丹丹，馬躍東，熊肇軍，劉 晨，4，董吁鋼，4

（1.貴州省人民醫院心內科，貴州貴陽 550002；2.中山大學附屬第一醫院心血管醫學部，廣東廣州 510080；3.中山大學附屬第三醫院心內科，廣東廣州 510630；4.衛生部輔助循環重點實驗室，廣東廣州 510080）

單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核細胞生物中一個重要的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶［1］。在運動、缺血、缺氧等情況下，細胞內AMP／ATP比值顯著升高時，AMPKα亞基的Thr172殘基發生磷酸化修飾后激活而具有生物活性［2］。AMPK的下游靶蛋白主要與糖、脂以及蛋白質等能量代謝調節有關［3-4］。有研究表明AMPK在平滑肌中參與了蛋白質降解的調控［5］，然而，AMPK是否參與心肌細胞蛋白質降解的調控，國內、外尚無相關報道。

3-甲基組氨酸（3-methylhistidine，3-MH）是存在于肌動蛋白和肌球蛋白中的一類轉錄后修飾的氨基酸［6-7］。由于缺乏特異性的tRNA，肌肉蛋白質在分解代謝時釋放的3-MH不能作為tRNA的底物參與新蛋白質的合成，因此，3-MH被認為是肌細胞蛋白質降解的生物學標志［8-9］。通過測定心肌細胞培養基中3-MH的濃度能夠反應心肌細胞肌纖維蛋白的降解率。本研究通過觀察AMPK激動劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷（5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR）對培養心肌細胞3-MH釋放率的影響，旨在探討AMPK在調控心肌細胞蛋白質分解代謝中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生1～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠，清潔級，由中山大學實驗動物中心提供。本實驗通過動物倫理委員會許可。

1.1.2 主要試劑及儀器 Dulbecco′s改良Eagle培養基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）／F12培養基、胎牛血清為美國HyClone公司產品，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購自美國 Gibco公司，AICAR、兔抗大鼠p-AMPK-α（Thr172）抗體、兔抗大鼠 AMPK-α抗體購自美國Cell Signaling（CST）公司，AMPK抑制劑Compound C為德國Merck公司產品，小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體購自上海康成生物工程有限公司，小鼠抗大鼠α-actinin抗體、羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）以及羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫印跡發光試劑盒為美國Millipore公司產品，3-MH標準品購自美國Sigma公司，色譜純甲醇為美國TEDIA公司產品。主要儀器包括：顯微成像分析系統（日本OLYMPUS公司）、電泳系統（美國BIO-RAD公司）、LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）、C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，日本GL Sciences公司）等。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞培養 在超凈工作臺內，無菌條件下取出乳鼠心臟，洗凈后將心室心肌組織剪碎成約1mm3大小，先后用0.05%Ⅰ型膠原酶和0.125% 胰蛋白酶消化，收集心肌細胞懸液至含10% 胎牛血清的培養基中，置于37℃，含5%CO2的培養箱內培養60min，差速貼壁法去除成纖維細胞，重懸的心肌細胞以5×105／mL的密度接種于6孔板，再放入5%CO2的培養箱內培養。待培養后細胞生長融合成片并出現同步收縮，換成無血清的培養基，饑餓24h后進行分組干預［10-11］。

1.2.2 心肌細胞的免疫化學染色鑒定 制作心肌細胞爬片，用4%多聚甲醛固定；再以3%H2O2孵育10min；滴加非免疫動物血清孵育10min；再滴加α-actinin第一抗體（1∶200）4℃過夜。次日加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育20min后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶，10min后二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，鏡下觀察。

1.2.3 心肌細胞的分組及總蛋白質的提取 為觀察AMPK特異性激動劑AICAR和AMPK抑制劑Compound C對AMPK蛋白表達以及磷酸化活性的影響，將心肌細胞按處理方式分為：對照組（未進行特殊處理）、AICAR組（培養基含AICAR 1mmol／L）、Compound C組（培養基含 Compound C 1μmol／L）及 AICAR＋Compound C 組（培養基含 AICAR 1mmol／L及Compound C 1μmol／L）。干預6h后提取總蛋白，采用Bradford法計算出樣品總蛋白濃度（μg／μL）。

1.2.4 Western blot檢測 各取50μg樣品蛋白進行8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結束后蛋白轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（80V，120min），5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入第一抗體工作液中，p-AMPK-α兔抗大鼠（1∶1 000）、AMPK-α兔抗大鼠（1∶1 000）、GADPH小鼠抗大鼠 （1∶20 000），4℃孵育過夜；次日PVDF膜再分別與HRP標記的羊抗兔或羊抗小鼠第二抗體室溫下孵育1h；免疫印跡用增強化學發光法（enhanced chemiluminecence，ECL）顯影、曝光，采用IPP 6.0圖像分析軟件檢測。以GAPDH作為內參，以灰度比值表示所檢測蛋白質的相對含量，實驗重復4次。

1.2.5 高效液相色譜儀檢測心肌細胞3-HT釋放量 參照課題組以前介紹的方法［11］，取0.5mL心肌細胞培養基加入100μL乙腈萃取。取100uL上清液加入100μL衍生化試劑和1mL硼酸緩沖液中（0.4mol／L），用0.22μm的針頭過濾器過濾后立即進樣20μL分析。用3-MH標準品準確配成一定濃度的標準液，將5個梯度體積的標準液制作標準曲線。將樣品中3-MH的峰面積帶入，計算出其含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件包進行統計學處理。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組兩兩比較采用Student Newman Keul′s（SNK）檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞的鑒定及純度 顯微鏡下觀察，體外培養的心肌細胞展開，80%以上融合成片，呈同步收縮。α-actinin免疫細胞化學染色顯示，陽性率大于99%，培養48h后的心肌細胞達到實驗要求。

2.2 AICAR對心肌細胞AMPK活性的影響 AICAR干預細胞6h后，各組心肌細胞總AMPK的表達無明顯差異，對照組、AICAR組、Compound C組及AICAR＋Compound C組心肌細胞p-AMPK／AMPK的灰度比值分別為：0.47±0.034、0.83±0.07、0.32±0.03及0.62±0.05。Western blot結果顯示，與對照組比較，AICAR組心肌細胞p-AMPK／AMPK灰度比值增高（P＜0.05），Compound C組心肌細胞p-AMPK／AMPK灰度比值降低（P＜0.05），提示AICAR激活心肌細胞AMPK，而Compound C則抑制AMPK激活；與AICAR組與比較，Compound C＋AICAR組p-AMPK／AMPK灰度比值降低（P＜0.05），提示Compound C逆轉了AICAR對心肌細胞AMPK的激活作用。見圖1。

圖1 AICAR對AMPK磷酸化激活的影響

2.3 AMPK活性對心肌細胞蛋白降解的影響 以3-MH的色譜峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，利用不同濃度的3-MH標準品與各自對應的峰面積建立回歸方程：Y=731 241 X＋896.86，相關系數r=0.999 8，在1.6μmo／L至107μmo／L的濃度范圍內3-MH濃度與峰面積線性關系良好。本實驗中所檢測的培養基中，3-MH濃度在4.8～68.3μmo／L范圍。研究結果顯示，與對照組比較，AICAR明顯促進細胞蛋白降解（P＜0.01），Compound C能夠抑制心肌細胞蛋白降解（P＜0.01）；Compound C還逆轉了AICAR對蛋白降解的促進作用（P＜0.01）。見圖2。

圖2 AICAR對心肌細胞3-MH釋放量的影響

3 討 論

AMPK是由一個相對分子質量為63×103的α亞基，一個相對分子質量為43×103的β亞基以及一個相對分子質量為38×103的γ亞基組成的異源三聚體［1］，是能量代謝的重要調節酶，對調控細胞的生長，增殖有重要作用［12］。作為機體能量調節器，AMPK能對心肌細胞內AMP／ATP比例變化反應迅速。在缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饑餓等情況下，心肌組織能量缺乏，AMP／ATP比例增加，繼而AMPK磷酸化激活。AMPK激活后通過調控代謝相關酶發揮能量代謝的調控作用［13-14］，如AMPK磷酸化激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）后增加脂肪酸的攝取和氧化；促進葡萄糖轉移酶4加速葡萄糖的攝取，刺激糖酵解，增加ATP生成；同時為了保存細胞內ATP水平，抑制蛋白質以及脂質合成，使細胞耗能活動減弱。以上這些調節反應使心肌細胞得以保持ATP的水平，有助于維持心肌細胞的功能。而蛋白質降解也是能量缺乏時機體反應的一部分，AMPK是否參與心肌細胞蛋白質降解的調控尚不清楚。本研究中，通過AMPK激動劑AICAR和抑制劑Compound C干預離體培養的心肌細胞，并應用高效液相色譜法檢測心肌細胞培養基中3-MH釋放量，發現AMPK激活后3-MH釋放明顯增加，而抑制AMPK活性后3-MH釋放顯著減少，以上結果提示AMPK能夠促進3-MH釋放，參與心肌細胞蛋白質降解的調控。

與其他組織、器官一樣，心肌細胞的蛋白質合成與降解之間有序的動態平衡受到嚴密調控。蛋白轉換同時存在于心肌細胞肥大和萎縮這兩種不同的病理過程中，只是合成與分解的相對比例不同［15］。心肌肥大和萎縮的本質是細胞內肌纖維蛋白量增減，因此，對心肌細胞肌纖維蛋白降解的檢測將有助于尋找有效逆轉心肌肥大的藥物以及客觀評價逆轉肥大藥物的治療效果。本研究結果發現，作為心肌細胞能量代謝重要調節酶的AMPK不僅調控心肌細胞葡萄糖和脂肪代謝，還參與蛋白降解的調控，提示其可能是心肌細胞肥大的治療靶點，為今后AMPK激活逆轉心肌細胞肥大的治療提供理論依據。然而，這需要通過構建心肌細胞肥大模型來進一步論證。此外，AMPK是一個蛋白激酶，并沒有水解功能，其如何調控蛋白降解也需要進一步探討。

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