降鈣素基因相關(guān)肽在COPD各時(shí)期中的變化*

張 偉，姚玉強(qiáng)，谷明明，孫璐璐，韓 佳

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250014)

臨床資料［1－2］表明：降鈣素基因相關(guān)肽(calctonin gene related peptid，CGRP)是倍受關(guān)注的舒血管物質(zhì)，具有很強(qiáng)的擴(kuò)張血管、支氣管及正性肌力作用。隨著對(duì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，CGRP與COPD的關(guān)系受到重視。中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有COPD的病名，但有關(guān)COPD的文獻(xiàn)記載較多，分別載于“咳嗽”“肺脹”“肺痿”“痰飲”等病之中。本研究以COPD為肺系病代表，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，模擬制作不同時(shí)期COPD的大鼠模型，觀察CGRP在COPD中變化規(guī)律，探討COPD對(duì)血管舒縮及心臟功能損傷的影響，同時(shí)結(jié)合理論對(duì)中醫(yī)“肺與心相關(guān)性“進(jìn)行分析探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康雄性Wistar大鼠32只，體質(zhì)量(200g±20)g，由山東大學(xué)提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK(魯)20090001。飼養(yǎng)在20～25℃、濕度40%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝食飲水。飼料為標(biāo)準(zhǔn)塊料，由山東中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.2 試劑與儀器

脂多糖(LPS)，美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品；FeCl3，濟(jì)南星聯(lián)星科技有限公司產(chǎn)品；CGRP ELISA試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；水合氯醛，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院提供，批號(hào)20120209；實(shí)驗(yàn)用香煙，焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg。煙熏箱(100 cm×80 cm×50 cm)及煙熏裝置，自制；TGL－16B型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；T25basic型勻漿機(jī)，IKA集團(tuán)產(chǎn)品；CX41－32RFL奧林巴斯光鏡病理圖像分析儀，產(chǎn)地日本。

1.3 分組與模型的建立

用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、COPD組、COPD急性加重組，COPD合并肺心病組4組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始造模。第1，14 天大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴 LPS 0.2 mL(200 μg)，第2～28天給予大鼠1 d 2次香煙煙熏，每次煙熏香煙12支，持續(xù)時(shí)間大約1 h，間隔4 h(滴LPS當(dāng)天不煙熏)。被動(dòng)吸煙方法：將大鼠放入煙熏箱內(nèi)，將香煙放入自制煙熏裝置中，點(diǎn)燃后，用打氣筒將香煙煙霧注入煙熏箱內(nèi)(1支煙燃燒5 min)，進(jìn)行被動(dòng)吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對(duì)大鼠的影響，采用冷凝管降低香煙溫度、濕度，并在箱底放置適量硅膠干燥劑。第28天氣管內(nèi)再次滴LPS制作COPD急性加重模型；從第16天每3天按2 μL/g體質(zhì)量經(jīng)尾靜脈緩慢注射6 g/L FeCI3制作COPD合并肺心病模型。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 一般情況

觀察大鼠的活動(dòng)度、對(duì)外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛及口唇鼻毛色澤、體質(zhì)量、飲食、呼吸等情況。

1.4.2 大鼠心、肺組織勻漿中CGRP含量

將大鼠麻醉后取出心、肺，各取組織200～500 mg，剪碎按1∶9比例加入生理鹽水，冰浴下用組織勻漿機(jī)15 000 r/min研磨制成100 g/L的組織勻漿，離心機(jī)2 500 r/min離心20 min，取上清液，ELISA法分別檢測(cè)心、肺組織勻漿中CGRP含量。

1.4.3 心、肺組織學(xué)觀察

將余下的心、肺組織用100 g/L中性福爾馬林充分固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片2張，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠活動(dòng)度可，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，皮毛光亮，口唇鼻無(wú)紫紺，體質(zhì)量較其他組大鼠重，飲食呼吸可。COPD組大鼠活動(dòng)度尚可，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，皮毛黃暗、無(wú)光澤，可聞及呼吸音、哮鳴音，活動(dòng)無(wú)明顯受限。COPD急性加重組大鼠活動(dòng)受限，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，皮毛黃暗、無(wú)光澤，可聞及呼吸音、哮鳴音，口唇紫紺，本組死亡2只，后補(bǔ)充2只。COPD合并肺心病組大鼠活動(dòng)受限，活動(dòng)后心跳明顯加快，呼吸急促，口唇紫紺，哮鳴音明顯。

2.2 各組大鼠心、肺組織中CGRP含量對(duì)比

見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心、肺組織中CGRP含量對(duì)比 ng·L －1， ± s

表1 各組大鼠心、肺組織中CGRP含量對(duì)比 ng·L －1， ± s

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01；與COPD組對(duì)比，##P ＜0.01；與 COPD急性加重組對(duì)比，△△P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 肺組織CGRP含量 心組織CGRP 含量正常對(duì)照組27.21 ±1.95 29.79 ±4.88 COPD 組 8 24.55 ±1.87* 24.10 ±3.80*COPD 急性加重組 8 15.90 ±2.09＊＊## 16.11 ±3.12＊＊##COPD合并肺心病組 8 22.34±2.44＊＊△△ 17.67±2.08 8##

2.3 各組大鼠心、肺組織學(xué)對(duì)比

各組大鼠心肌組織學(xué)對(duì)比，見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組(圖A1)大鼠心肌組織正常；COPD組(圖B1)心肌細(xì)胞輕度嗜酸性變；COPD急性加重組(圖C1)心肌細(xì)胞嗜酸性變，部分間質(zhì)疏松，脂肪細(xì)胞增生。COPD合并肺心病組(圖D1)心肌細(xì)胞嗜酸性變，間質(zhì)疏松，脂肪細(xì)胞增生，個(gè)別心肌細(xì)胞變性。

圖1 各組大鼠心肌組織(HE，200×)

各組大鼠肺組織學(xué)對(duì)比，見(jiàn)圖2。正常對(duì)照組(圖A2)肺組織間質(zhì)充血，輕度增生；COPD組(圖B2)肺支氣管周?chē)匝准?xì)胞浸潤(rùn)，支氣管內(nèi)壞死性炎癥。COPD急性加重組(圖C2)肺間質(zhì)充血增生。COPD合并肺心病組(圖D2)肺組織局灶性壞死性炎癥，肺淤血，間質(zhì)增生，慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 各組大鼠肺組織(HE，200×)

3 討論

“肺心相關(guān)論”是中醫(yī)臟腑相關(guān)理論的重要組成部分，揭示了人體臟腑之間相互影響、相互作用的關(guān)系。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病多屬漸積而成，秉承纏綿，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，難期根治。心肺相鄰，同居上焦，合主一身之氣血。由于心肺之氣斡旋于胸中，保證氣血正常運(yùn)行，使其循環(huán)表里，晝夜不息，謂之“氣行血行，氣止血止”。肺的宣發(fā)需要心陽(yáng)的溫煦，心血的運(yùn)行需要宗氣的貫注，而宗氣的形成與肺的呼吸功能密切相關(guān)。若肺氣虛或肺失肅降，肺不布津，影響津液的敷布和排泄障礙，水液停聚生痰；肺朝百脈，若宣化不能，宗氣無(wú)以“貫心脈行氣血”，肺不能正常行其朝百脈之職，氣機(jī)不暢、心脈痹阻而發(fā)病。由此可見(jiàn)，心肺在生理上相互聯(lián)系，功能上相互作用，病理上相互影響。

CGRP在肺心病、肺動(dòng)脈高壓形成、肺循環(huán)調(diào)節(jié)、氣道及心臟功能穩(wěn)定等方面有重要作用［3－4］。CGRP能降低肺動(dòng)脈壓，使肺通氣/血流比獲得改善。本研究中COPD急性加重組和COPD合并肺心病組大鼠CGRP下降顯著，提示CGRP可能是COPD病情加重的一個(gè)重要體液因素，也可能是誘發(fā)肺心病形成的重要因素之一。COPD急性加重組大鼠和COPD合并肺心病組大鼠CGRP均在低水平，且COPD急性加重組表達(dá)最低，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡率最高，提示CGRP的失衡可能與死亡率有一定相關(guān)性。CGRP水平失衡的存在，可能是心功能損害的一個(gè)原因。CGRP在COPD各時(shí)期處于低水平的機(jī)制尚不清楚。COPD時(shí)，體內(nèi)缺氧、肺部炎癥、肺動(dòng)脈高壓及右心室肥厚均可引起CGRP的失衡，改善CGRP的水平可能是治療COPD、降低急性加重期死亡率以及預(yù)防肺心病形成的一個(gè)有益途徑。

本研究通過(guò)COPD的發(fā)生機(jī)制和肺心相關(guān)性的現(xiàn)代研究，充分說(shuō)明肺與心之間的密切相關(guān)性，進(jìn)一步揭示了“肺與心相關(guān)性”的意義與內(nèi)涵。本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)理論的內(nèi)涵為指導(dǎo)，選擇相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室量化、標(biāo)準(zhǔn)化研究，使“肺與心相關(guān)性”理論客觀化、直觀化，為中醫(yī)理論的研究提供了一定的思路和啟示。

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