石榴皮總黃酮的微波提取工藝及含量測(cè)定研究

霍文 張衛(wèi)國 王雅寧

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000）

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，為《中國藥典》歷版收載的品種，具有澀腸、止血、驅(qū)蟲等功效[1]，含有黃酮類、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類等多種化合物。近年來發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的生理活性較為廣泛，在抗誘變、抗腫瘤、抗微生物、抗衰老等方面具有良好的作用，并具有清除自由基和抗氧化的能力。此外，黃酮類化合物還能調(diào)節(jié)心肌收縮、降血壓、防止血管破裂、止血、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗微生物、抗腫瘤和改善心肌舒張功能，可以提高機(jī)體在常壓與低壓下的耐缺氧能力，對(duì)抗各種因素造成的心律失常[2]。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微波法提取石榴皮中總黃酮的工藝進(jìn)行研究，并測(cè)定總黃酮含量，旨在為石榴皮的進(jìn)一步開發(fā)利用以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TV-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），微波催化合成/萃取儀（祥鵠科技），KDC-1042低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份公司中佳分公司）。

1.2 試藥

石榴皮藥材購自唐山市醫(yī)藥公司藥材站，產(chǎn)地四川，經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為石榴科石榴的的干燥果皮。蘆丁對(duì)照品購自原中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品（作為黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品）0.010 7 g，置于50 mL量瓶中，加適量60%乙醇，于水浴上微熱溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻，配置成0.214 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 檢測(cè)波長的確定

吸取蘆丁對(duì)照品溶液7.5 mL置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁 1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉10 mL，搖勻，并用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min顯色[3]。于紫外可見分光光度計(jì)上在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，蘆丁在501 nm下有最大吸收，故選其作為測(cè)定波長。

2.3 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液 0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL置于50 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法顯色，在501 nm處測(cè)定溶液的吸光度（A）值，以A值對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸分析，表明蘆丁在0.010 7～0.053 5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系?；貧w方程為

A=14.075 C－0.037 2

r=0.999 8（n=5）。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率500 w，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為 20%，40%，60%，80%條件下，作用1 min，間歇提取3次。 在轉(zhuǎn)速2 000 r/min條件下進(jìn)行低速離心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，搖勻。

精密量取上述量瓶中溶液各2 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法顯色，在501 nm處測(cè)定A值，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，A值增加。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%后，A值有所下降。說明體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液相對(duì)其他濃度能更好地提取出石榴皮中的黃酮類化合物。

2.4.2 微波時(shí)間的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率 500 w，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%條件下，分別作用 60，90，120，150 s，間歇提取3次，按照2.4.1項(xiàng)下步驟配制供試品溶液并顯色測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

隨著微波時(shí)間的增加，A值增加。在120 s時(shí)達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間增加A值反而下降。說明微波作用120 s提取石榴皮中的總黃酮較為適宜。

2.4.3 料液比的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各2.0 g，在微波功率500 w，乙醇濃度為60%，料液比分別為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 條件下，作用1 min，間歇提取3次。按照2.4.1項(xiàng)下步驟配制供試品溶液并顯色，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取的影響

可見，料液比為1∶20時(shí) A值最大，隨料液比增高，A值反而下降，說明提取率有所降低。

2.4.4 微波功率的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各2.0 g，在乙醇濃度為60%，料液比為1:20，微波功率分別為 300，400，500，600 w 條件下，作用1 min，間歇提取3次。按照2.4.1項(xiàng)下步驟配制溶液并顯色，結(jié)果見圖4。

可見，隨著微波功率的增加，A值無明顯變化（P＞0.05），說明微波功率對(duì)石榴皮中總黃酮的提取無明顯影響。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮提取的影響

2.5 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)對(duì)上述不同提取工藝參數(shù)進(jìn)行了初步的篩選；為確定最佳提取工藝，同時(shí)進(jìn)行了正交試驗(yàn)。參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，可知微波功率對(duì)石榴皮中總黃酮的提取無顯著影響，故進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)可考慮忽略此因素的影響。因此設(shè)計(jì)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)（A）、微波作用時(shí)間（B）及料液比（C）3個(gè)影響因素，在各自的不同水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[4]，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析結(jié)果見表 1，2，3。

方差分析結(jié)果顯示，因素A具有顯著性差異（F 比＞F0.05，2.2=19.0），而因素 B，C 不具有顯著性（F 比＜F0.05，2.2=19.0），即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取具有顯著的影響。

由表2，3結(jié)果可知，A和C對(duì)石榴皮中總黃酮的提取有較大影響，B影響較小。故最佳提取工藝為A2B3C3。即乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%、料液比1∶25、微波時(shí)間為120 s。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.6 樣品含量測(cè)定

精密稱定5份石榴皮粉末各2.0 g，在料液比1∶25，微波功率 500 w，乙醇濃度為 60%條件下，分別作用 120 s，間歇提取3次。2 000 r/min條件下進(jìn)行低速離心，離心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，搖勻，得供試品溶液。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

精密量取上述量瓶中溶液各1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法顯色，在501 nm處測(cè)定A值，見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

2.7 精密度試驗(yàn)

精密稱定石榴皮粉末2.0 g，按2.6項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取上述溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法顯色，于501 nm處連續(xù)測(cè)定A值6次，RSD為0.205%，說明供試品溶液精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取含量測(cè)定項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液每隔10 min測(cè)定1次A值，結(jié)果在 40 min內(nèi)A值無顯著變化，RSD為2.34%，說明供試品溶液在40 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.9 加樣回收率的測(cè)定

取已知含量的石榴皮粉末5份，每份約2.0 g，精密稱定。按2.6項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密量取上述供試品溶液各1 mL，置于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL蘆丁對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下方法顯色，于501 nm處分別測(cè)定A值，計(jì)算回收率，見表 5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

取一定濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，采用硝酸鋁顯色法，在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在370 nm附近和501 nm處分別有最大吸收，但在501 nm處光譜峰峰形更理想，而在370 nm附近光譜峰較為雜亂，故選定501 nm為檢測(cè)波長。

3.2 黃酮類成分提取方法的選擇

黃酮類成分常用加水煎煮法、堿提酸沉法或乙醇、甲醇浸泡提取法,費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、提取率低。微波提取法利用微波能迅速破壞細(xì)胞壁加快活性成分溶出，使許多難溶性物質(zhì)在微波電磁場的作用下得到較好溶解，從而提高了提取速度和得率[5]，因此與常規(guī)提取方法相比具有選擇性強(qiáng)，耗時(shí)短，能耗低，排污量少[6]，溶劑用量少，提取效率高，有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)，故本研究采用微波提取法。

3.3 總黃酮含量測(cè)定方法的選擇

分光光度法一般用于總黃酮含量測(cè)定，由于其他組分干擾，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，多需進(jìn)行顯色測(cè)定。利用黃酮類與金屬鹽類試劑顯色，再進(jìn)行光譜測(cè)定，能顯著提高含量測(cè)定的選擇性及靈敏度[7]。故本實(shí)驗(yàn)選擇硝酸鋁顯色法，方法準(zhǔn)確可靠。劉苑等[8]采用直接紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，于360.5 nm處測(cè)定了毛茛藥材不同萃取部位的總黃酮含量，平均回收率均在95%～105%范圍內(nèi)。薄層掃描法和高效液相色譜法是測(cè)定單體黃酮有效方法[7]。如黃芩苷、槲皮素和葛根素等均為黃酮類主要代表成分，有報(bào)道[9]采用反相高效液相色譜法測(cè)定五味安神顆粒中葛根素的含量，方法靈敏度高，重復(fù)性好，簡便準(zhǔn)確，平均回收率為100.1%。羅愛勤等[10]采用HPLC測(cè)定腎石通顆粒中槲皮素含量，方法靈敏、準(zhǔn)確，平均回收率為98.8%，可作為腎石通顆粒的質(zhì)控方法。因此對(duì)含有黃酮類成分的中藥材和制劑，可按要求選擇不同方法測(cè)定總黃酮或單體黃酮進(jìn)行質(zhì)量控制。

本研究確定了微波提取法提取石榴皮藥材中總黃酮的最佳提取工藝，測(cè)定了總黃酮含量，為石榴皮開發(fā)利用和藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考依據(jù)，且該方法具有良好的應(yīng)用前景。

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