10種中藥對雞白痢沙門菌的體外抗菌活性測定

張德顯，陳耀楠，南匯珠，杜婷婷，付喜愛，劉明春

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽110866）

沙門菌（Salmonella）屬于腸桿菌科沙門菌屬，是人和動物腸道中形態(tài)、培養(yǎng)特性、反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)相似的革蘭陰性菌。沙門菌中某些特定的血清型能夠引起雞的沙門菌病，對養(yǎng)雞生產(chǎn)及食品衛(wèi)生具有較大危害。常常采用抗生素治療雞的沙門菌病，但是耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)使許多抗生素降低或失去治療作用，因此迫使研究者尋找新的藥物對耐藥菌引起的疾病進(jìn)行治療。中藥以其殘毒低、能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而在防治疾病中的作用日益顯現(xiàn)。本試驗(yàn)對10種中藥對分離雞沙門菌的體外抑菌活性進(jìn)行檢測和篩選，為臨床合理用藥、有效防治雞沙門菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 中草藥 大青葉、魚腥草、黃芩、黃連、穿心蓮、黃柏、烏梅、大黃、金銀花和連翹，均購自沈陽南塔大藥房；氧氟沙星，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1．1．2 培養(yǎng)基 MH肉湯和 MH瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，按說明書配制。

1．1．3 菌株 雞白痢沙門菌分離自沈陽郊區(qū)各雞場，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1．2 方法

1．2．1 菌液制備 將已鑒定、保存的沙門菌活化后，接種于3mL MH培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18h，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為105～106CFU／mL。

1．2．2 中藥煎煮液的制備 采用水提法，10種中藥各取50g加蒸餾水500mL室溫浸泡30min后煮沸，煮沸后文火煎煮1h，8層紗布過濾，濾渣加水250mL煮沸30min，合并2次濾液，在水浴鍋內(nèi)70℃濃縮至50mL，即得濃度為1g／mL的藥液。藥液裝入鹽水瓶中，流通蒸汽滅菌30min，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 體外抑菌試驗(yàn)

1．2．3．1 藥敏紙片的制備 將用打孔器打好的直徑為6mm的小濾紙圓片裝入青霉素小瓶內(nèi)，每100片為一瓶高壓滅菌，在無菌操作臺內(nèi)取1mL藥液浸泡青霉素小瓶內(nèi)的紙片，充分浸泡，在超凈臺內(nèi)放置24h，晾干置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3．2 抑菌試驗(yàn) 采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，具體方法見參考文獻(xiàn)［1］。

1．2．3．3 最低抑菌濃度（MIC值）的測定 根據(jù)單味中藥的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選取對沙門菌具有較好抑菌效果的單味中藥，并測定其MIC值。將制備好的烏梅醇提物按比例加入50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，最終培養(yǎng)基含有水提物的質(zhì)量濃度分別為6．0、5．5、5．0、4．5 、4．0、3．、3．0、2．5、1．25mg／mL，倒平板，以不添加烏梅醇提物的平板作對照。將菌種涂布于各平板，37℃培養(yǎng)18h，進(jìn)行菌落計數(shù)。同對照比較，添加有醇提物的平板的菌落數(shù)比對照平板菌落數(shù)減少90%即為MIC［2］。

1．2．3．4 pH值對不同中藥抑菌效果的影響選取抑菌效果較好的幾種中藥，用酸、堿溶液調(diào)節(jié)中藥提取液的pH值，制成pH 值分別為4、5、6、7、8、9的溶液，參照1．2．3．2方法，測定不同中藥的抑菌圈直徑。

1．2．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 單味中藥對沙門菌的抑菌效果 10種中藥對沙門菌的體外抑菌活性測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，10味中藥對沙門菌的抑菌效果各不相同，其中，黃連和烏梅對沙門菌抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑分別為12．78±2．63mm和14．58±3．45mm，黃芩、魚腥草和金銀花對雞白痢沙門菌的抑菌圈直徑分別為9．75±1．34、8．37±1．79mm、和8．18±2．64mm；大青葉、穿心蓮、黃柏、大黃和連翹中藥對沙門菌抑菌效果不明顯。

2．2 pH值對中藥抑菌效果的影響 pH值對中藥抑菌效果的影響如圖1所示。在pH值為4和9時，烏梅對雞白痢沙門菌的抑菌圈直徑分別為15．37±3．46mm和8．75±2．01mm。表明隨pH值的升高，烏梅對雞白痢沙門菌的抑菌效果降低；黃連的抑菌效果隨pH值的升高而稍有增加，pH值對黃芩的抑菌效果幾乎無影響。

表1 10種中藥對沙門菌抑菌效果測定

3 討論

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的各種年齡雞都可能發(fā)生的一種傳染性疾病，雞白痢的發(fā)病率一般為20%～30%，死亡率高。中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性，且能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能及不易產(chǎn)生殘留等特點(diǎn)，在雞感染性疾病的防治中逐漸得到應(yīng)用［3］。侯麗麗等使用中藥制劑“地榆散”對雞白痢沙門菌人工感染雞進(jìn)行治療，結(jié)果表明“地榆散”的治愈率為90%，治療效果接近氧氟沙星粉對照組［4］。劉立新等采用中藥抑制劑對耐藥雞白痢沙門菌人工感染雞進(jìn)行治療，中藥抑制劑的治愈率達(dá)到70%［5］。這提示中藥是治療雞白痢沙門菌病的一個重要途徑，也是防止和控制細(xì)菌耐藥性的重要途徑之一。

本試驗(yàn)通過測定10種中藥對雞白痢沙門菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)黃連、烏梅對雞白痢沙門菌具有較好的抑制效果，其中烏梅對雞白痢沙門菌的抑菌效果最好。耿飛等研究發(fā)現(xiàn)，烏梅提取液對李斯特菌的抗菌活性較強(qiáng)（MIC值為0．625mg／mL），其作用機(jī)理為烏梅提取物能夠作用于李斯特菌的細(xì)胞膜系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)而抑制李斯特菌的生長繁殖［6］。本試驗(yàn)中，烏梅水提液對雞白痢沙門菌的MIC值為1．83 mg／mL，與耿飛等的結(jié)果相比，抑菌效果略差，可能是由于細(xì)菌菌株不同的結(jié)果。劉夢茵等對乙醇提取物在不同pH值之條件下對蠟狀芽孢桿菌等的抑菌效果進(jìn)行對比，結(jié)果表明，烏梅醇提物的最佳pH值為5～6［7］。本試驗(yàn)對烏梅抑菌效果的最佳pH值進(jìn)行研究結(jié)果表明，烏梅提取液在pH值5時產(chǎn)生最佳抑菌效果，抑菌圈直徑為15．58±4．14mm，與劉夢茵等報道的結(jié)果一致。

本試驗(yàn)中，黃連和烏梅對臨床分離株雞白痢沙門菌具有很好的抑制效果，因此深入研究這兩種藥物對雞白痢沙門菌的抑菌作用，對控制耐藥菌的感染與蔓延具有非常重要的實(shí)際意義。另外，中藥的抑菌成分復(fù)雜，受外界因素影響比較多，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH值對烏梅的抑菌效果產(chǎn)生明顯影響，因此，在研究中藥的抗菌活性時，應(yīng)考慮溶液pH值的影響。

［1］ 郭積燕．微生物檢驗(yàn)技術(shù)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：52－69．

［2］ 馮仁豐．食品實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)［M］．上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1996：85－93．

［3］ 張克家．中藥用于防治動物傳染病的現(xiàn)狀與思考［J］．中國獸醫(yī)雜志，2007，43（5）：38－39．

［4］ 侯麗麗，程建國，寧炳渭，等．中藥“地榆散”防治雞白痢病的研究與應(yīng)用［J］．中國動物保健，2011，6：16－19．

［5］ 劉立新，劉芳萍，李睿，等．雞白痢沙門氏菌耐藥性中藥抑制劑的臨床治療效果［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，1：89－91．

［6］ 耿飛，王偉，周濤．烏梅提取液對李斯特菌的抑菌機(jī)理［J］．食品科學(xué)，2011，32（15）：88－93．

［7］ 劉夢茵，劉芳，周濤，等．烏梅乙醇提取物抑菌作用及其抑菌成分分析［J］．食品科學(xué)，2011，32（17）：190－193．