豬Centaurin－α1的克隆分析與原核表達載體構建

馬金友，余 燕，劉俊偉，徐之勇，朱巖昆，陳金山

（河南科技學院動物科學學院，河南 新鄉453003）

豬病毒病的暴發是長期制約生豬養殖和豬肉產品加工迅速發展的重要因素之一，尤其是2006年以來豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株引起的高熱病的暴發使養豬業遭受了重大經濟損失，因此，通過“預防為主”，提高豬只的自身免疫能力以增強其抗病力，是解決豬病及抗生素等藥物濫用問題的一條非常有效的途徑。目前，對于PRRSV免疫預防研究工作已經取得了一些進展［1－2］，但對病毒入侵宿主細胞后，一些相關免疫因子對病毒感染過程中的囊泡運輸系統是如何調控的還知之甚少，尤其在病毒的復制或參與病毒防御等方面。

Centaurin－α1是Centaurin蛋白家族中第一個被發現的成員，該基因于1996年首先在大鼠腦中被克隆得到，其可以特異性地通過PH結構域與3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PtdIns（3，4，5）P（3））相結合，使 Centaurin－α1蛋白向細胞膜上遷移，通過 Ras－Raf－MEK－ERK1／2途徑調控細胞功能，從而參與到信號轉導通路中［3－4］，對Centaurin－α1的研究主要是其作為ARF6的GAP（GTPase－activating protein）所行使的調控功能［5］。作為ARF的GAP，Centaurin－α1通過對ARF的調控而間接地參與到了病毒和抗病毒感染過程中［6］，同時，作為細胞信號轉導PI3－K途徑下游的重要成員［4，7］，我們仍可以預見，Centaurin－α1可能與豬只抗病毒免疫密切相關。

由于Centaurin－α1在PRRSV感染中的免疫防御作用和調節機制缺乏了解，本文擬通過豬只Centaurin－α1基因的克隆與分析，構建該基因的原核表達載體以獲得抗血清，為進一步研究豬Centaurin－α1在PRRSV感染過程中的調控作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

1.1.1 常用試劑 限制性內切酶EcoRⅠ與HindⅢ、反轉錄酶 M－MLV、Taq DNA 聚合酶，pMD18－T載體、質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase，均購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；槍頭和離心管（Axygen），購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其他常用試劑均為國產分析純試劑；pET－His載體和大腸桿菌（Escherichia coli Top10）由本實驗室保藏。

1.1.2 主要設備 PCR儀，凝膠成像系統，水平電泳槽，電泳儀，超凈工作臺，臺式冷凍離心機，隔水式恒溫培養箱，恒溫搖床，電子精密天平，高壓滅菌鍋，制冰機等。

1.2 材料 從動物科學學院獸醫院取疑似PRRSV感染的杜洛克豬肺、腦、淋巴結、心臟等少量組織，液氮凍存帶回實驗室處理。

1.3 引物設計 根據NCBI（National Center for Biotechnology Information）豬 Centaurin－α1（M ＿214226）序列設計擴增Centaurin－α1全長ORF引物（CentF：5′－ATGGCCAA－GGAGCGGCGG－3′ 和CentR：5′－CGCTAGGGTTTATGC－TTGAAGTG－3′，上海生工生物工程技術服務有限公司合成）和原核表達引物（Sus－CenF1：5′－GCGAATTCATCTGCCTGAGCTGCTTG－3′ 和 SusCenR1： 5′－CGAAGCTTCGCTAGGGTTTATG－CTTGAAG－3′，上海生工生物工程技術服務有限公司法合成，下劃線為酶切位點）。

1.4 方法

1.4.1 豬Centaurin－α1基因擴增

1.4.1.1 組織總RNA提取 取適當組織（200mg以下）于研缽（180℃烘烤3h）中加入液氮充分研磨，然后加入1 000μL Trizol（Invitrogen）混勻，分裝為2管，再分別加入Trizol補充至每管1 000μL，混勻（1管凍存，1管用于試驗），室溫放置10min；12 000r／min（4℃）離心10min；上清轉移至一新管，加入0.2mL氯仿／每1 000μL Trizol，劇烈搖動15s左右，室溫放置8min左右；12 000r／min（4℃）離心15min；上層水相轉移至一新管中，加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫放置8min；12 000r／min（4℃）離心8min；棄上清，1mL 75%乙醇洗1min，7 500r／min（4℃）離心5min，重復洗1次；棄上清，空氣干燥3min，加入60μL DEPC水溶解沉淀。

1.4.1.2 cDNA合成 首先配制以下成分：1μL 6 mer隨機引物，4μg 總 RNA，1μL 10mmol／L dNTP混合物，DEPC水補充到14μL；PCR儀中65℃加熱5min，然后冰浴至少1min；輕微離心一下，然后加入以下成分：4μL 5×first－strand Buffer，1μL Rnase inhibitor，1μL反轉錄酶 M－MLV；PCR儀中25℃溫浴5min，42℃溫浴60min，70℃加熱15min以失活成分，4℃后保存冰箱中備用。

1.4.1.3 Centaurin－α1基因擴增 PCR 反應管中分別加入以下成分：5×Prime－STARTMBuffer 5 μL，2.5mmol／L dNTP混合物2μL，上下游引物各1.0μL，10倍稀釋的反轉錄產物2.0μL，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase 0.25μL，補充滅菌三蒸水至25μL。PCR反應程序如下：95℃，3min；98℃10s，55℃15s，72℃70s，30個循環；72℃再延伸5 min，4℃終止。

1.4.2 基因擴增產物的回收、連接和測序 檢測擴增的目的片段，根據DNA回收試劑盒說明回收目的片段；0.5mL離心管中依次加入：載體（pMD18－T）0.5L，目的片段6.0L，10×Liga－tion Buffer 1.0L，T4Ligase 0.6L，滅菌三蒸水補充至10.0 L，16℃連接6h；連接產物轉化Top 10細菌和轉化細菌的檢測及測序，正確測序產物質粒的提取、保存。

1.4.3 序列分析 分別運用 Clustal X［8］和 Blast程序 （http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／）及Signal P 4.0 （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）分析核酸序列和預測蛋白的保守結構域及信號肽。通過 MEGA 4.0［9］程序的鄰接法（Neighbor－Joining，NJ，bootstrap1000）構建了相關物種Centaurin－α1的系統發生樹。

1.4.4 豬 Centaurin－α1融合蛋白原核表達質粒構建

1.4.4.1 Centaurin－α1基因表達序列的擴增 除擴增引物為SusCenF1和SusCenR1及模板為提取含Centaurin－α1序列質粒外，其他成分和程序參照1.4.1.3的成分和步驟。

1.4.4.2 擴增的 Centaurin－α1序列和連接載體酶切及回收 1.5mL Eppendorf管中分別依次加入：內切酶緩沖液（10xK）5.0L；DNA片段和pET－His分別為43.0L；EcoRⅠ1.0L，HindⅢ1.0L，37℃酶切2.5h。酶切后的片段回收按照DNA回收試劑盒說明進行。

1.4.4.3 載體和目的片段連接、轉化及檢測 0.5 mL離心管中依次加入：酶切載體（pET－His）1.5 L，待連接的酶切 Centaurin－α1片段6.5L，10×Ligation Buffer 1.0L，T4Ligase 1.0μL，總體積10.0L，16℃連接6h。連接產物轉化Top 10細菌，轉化細菌的菌落檢測和質粒雙酶切檢測驗證，符合要求的菌落測序，正確測序產物質粒的提取、保存。

2 結果

2.1 豬Centaurin－α1基因ORF的克隆與分析

2.1.1 豬Centaurin－α1基因ORF的克隆 通過豬腦和肺臟組織總RNA的提取、反轉錄和基因的擴增，得到了和目的基因一致的條帶（圖1），測序后確認為豬Centaurin－α1基因，大小為1 100bp左右。

圖1 克隆的豬Centaurin－α1電泳圖

圖2 豬Centaurin－α1基因全長序列和蛋白序列中的保守結構域

2.1.2 豬Centaurin－α1基因ORF及結構特征 豬Centaurin－α1基因包含一個長度為1 122bp開放閱讀框，預測編碼374個氨基酸，理論分子質量約為43.50kDa，pI為8.95（圖2，A）。

通過NCBI Blast尋找其序列中的保守結構域，我們發現，豬Centaurin－α1蛋白包含一個Arf GAP和兩個PH結構域（圖2，B）。信號肽預測該蛋白前22個氨基酸為信號肽序列。

2.1.3 豬Centaurin－α1分子系統分析 根據 Centaurin－α1氨基酸序列構建的 NJ樹（Neighbor－Joining tree）顯示：該蛋白首先與牛 Centaurin－α1聚為一類，說明其與牛Centaurin－α1親緣關系較近，這從它們同為偶蹄目動物能夠得到進一步的證實，與哺乳動物中人和嚙齒目動物也有較高的同源性，而和魚綱中的斑馬魚和兩棲類的非洲爪蛙親緣關系稍遠（圖3）。

圖3 構建的豬Centaurin－α1NJ樹

2.2 豬Centaurin－α1融合蛋白原核表達載體構建由于Centaurin－α1是細胞中調控囊泡運輸蛋白的重要因子，對病毒的入侵起著重要的調控作用，為了獲得抗血清進一步研究它的功能，對其原核表達載體進行構建。通過設計的原核表達引物經PCR從質粒pMD18－T－Centaurin－α1中克隆表達序列，雙酶切后連接到pET－His載體上，通過菌落PCR獲得了和目的片段大小一致的條帶，挑選的菌落培養后提取的質粒雙酶切圖譜（圖4）進一步證實構建融合蛋白表達載體的正確性。根據克隆的Centaurin－α1基因，我們成功構建了豬Centaurin－α1原核表達載體用于融合蛋白的表達。

圖4 構建的豬Centaurin－α1融合蛋白表達載體雙酶切

3 討論

PRRSV是影響世界豬產業發展的重要流行性傳染病之一，具有導致懷孕母豬發生流產、早產和死胎等嚴重病癥特點，尤其2006年后該病的暴發使養豬業遭受了重大損失。在研究中發現PRRSV感染早期豬Centaurin－α1基因表達明顯上調，說明豬Centaurin－α1因子可能參與了早期病毒感染的防御作用。目前，國內外關于Centaurin蛋白家族的報道還非常少，作為這個家族中最早被發現的成員，Centaurin－α1在人們的研究中大多數都還僅限于它與ARF6的關系。然而，從Centaurin－α1蛋白所具有的保守結構域上，我們不難看到該蛋白可能具有的功能和作用是不容忽視的。因為Centaurin－α1不僅可以作為ARF6的GAP，從而間接參與到細胞吞噬、細胞運動和物質運輸等活動中，它擁有的兩個PH結構域及可與第二信使3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇特異性結合的能力也暗示了它可能在細胞信號轉導中具有重要地位。而且，根據文獻報道，Centaurin－α1可能是重要細胞信號轉導途徑PI3－K途徑下游的成員［7］，盡管目前在這方面還沒有具體的研究，但是我們仍是可以預見Centaurin－α1可能與豬的相關病毒入侵有著密切的相關性。

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