抗柔嫩艾美耳球蟲ScFv－PE40重組毒素的活性測定

郝景鋒，吳 斌，蔡華東，趙 權

（1．吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林 132101；2．吉林省磐石市園藝特產技術推廣站，吉林 磐石 132300；3．吉林農業大學研究生院，吉林 長春 130118）

作為雞球蟲病主要的病原體之一，柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）對雛雞的危害非常嚴重，針對柔嫩艾美球蟲病，目前主要依靠藥物防治和疫苗免疫。由于藥物防治存在耐藥性和藥物殘留問題，效果不太理想；同時，活苗免疫不但具有潛在的致病力，而且生產成本較高，免疫程序復雜，特別是免疫后的監測和管理技術要求較高，不能得到廣泛應用［1］。這就需要找到其他更為安全、簡單、廉價、有效的防治措施。近些年來，多種球蟲保護性抗原基因被克隆表達，在已經報道E．tenella基因中，ScFv基因編碼的抗原位于子孢子折光體上，在球蟲孢子生殖階段過渡到裂殖生殖階段發揮很重要的生物學功能，其基因表達產物具有一定的免疫保護作用，而且對其他球蟲具有一定的交叉保護［2］。因此，利用分子生物學技術研制基因工程疫苗已成為當前防治球蟲病較為理想的選擇。

本實驗室已經對E．tenella子孢子表面抗原ScFv基因進行了克隆和序列測定，將目的基因連接pET28a（＋）載體進行原核表達后，對海藍小公雛感染柔嫩艾美耳球蟲的保護效果進行觀察評價，為進一步在臨床上控制雞球蟲病提供科學的依據。

1 材料與方法

1．1 材料 重組免疫毒素（吉林農業大學寄生蟲實驗室饋贈）：本試驗構建重組毒素時使用的是pET28a（＋）表達載體，因其表達的蛋白產物N末端包含His－Tag，所以能夠采用金屬Ni2＋親和層析柱方法純化該目的蛋白。試驗動物：1日齡海藍小公雛，購自長春市北方養雞場。E．tenella蟲株，由吉林農業大學寄生蟲實驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 試驗分組 設立陰性對照（非感染非免疫對照組）為第1組，陽性對照（感染非免疫對照組）為第2組，試驗組即重組免疫毒素組為第3組。

1．2．2 試驗設計 試驗動物選取1日齡的球蟲檢測陰性海藍公雛雞，飼養至12日齡隨機分成3組，每組20羽，自由飲水采食，首免于14日齡，100μg／羽，胸部肌肉注射，采用同樣劑量于21日齡加強免疫，于28日齡先稱重，每羽口服1×105個易感染的E．tenella孢子化卵囊，逐日觀察記錄精神狀態以及死亡數量，36日齡宰殺，逐只稱重、盲腸病變計分以及卵囊計數，計算ACI，應用SPSS 13．0軟件進行數據分析。

1．2．3 抗球蟲效果的判定

1．2．3．1 盲腸病變值與判定指標 36日齡試驗雞先稱重，宰殺，按Johnson方法判定盲腸病變記分，標準如下：剖檢未見任何病變記為0分；盲腸壁出現極少數出血點且內容物正常記作＋1；盲腸出血，腸壁肥厚，有出血點記作＋2；盲腸出現栓塞，大量出血，腸壁萎縮或者變形記作＋3；盲腸內出現栓芯或者凝血塊，盲腸萎縮嚴重，腸壁增厚記作＋4。若兩側病變程度不相同時，按照病變較嚴重側計算［3］。

病變值＝各組平均病變記分×10

1．2．3．2 OPG值測定 從感染后第5天開始，每天收集1～5組的糞便至攻蟲后第9天。采用司陶爾蟲卵記數法測定OPG值［4］。

表1 克盲腸內容物卵囊值換算標準

1．2．3．3 增重 本次增重指標的測定范圍是20～36日齡，計算公式如下：平均增重＝撲殺時平均體重一攻蟲前平均體重；平均增重率＝平均增重／攻蟲前平均體重

相對增重率（%）＝平均增重率／陰性對照組平均增重率×100%

1．2．3．4 抗球蟲指數（ACI） 根據如下公式計算：ACI＝（相對增重率＋存活率）－（病變值＋卵囊值）

ACI＞180時即為保護效果明顯；ACI為160～179時即為保護效果較好；ACI為160～120時即為保護效果一般；ACI＜120時即為無保護效果［5］。

2 試驗結果

2．1 臨床癥狀觀察結果 21日齡后第3組雞未出現明顯異常狀況，各雞只精神狀態良好。攻蟲后第5天，第2、3組試驗雞只陸續出現精神沉郁，食欲減退，第2組雞糞便出血嚴重，第3組糞便少量出血。各試驗組分別用飽和食鹽水漂浮法進行卵囊計數，結果顯示已有卵囊生成。第2，3組雞于感染后第6～9天均檢出卵囊，第2組卵囊數量較高。期間第1組雞未出現任何異常，糞檢時無卵囊出現。

2．2 雞只增重變化 從表2可以看出，使用SPSS 13．0軟件進行統計分析，攻蟲前，各試驗分組差異均不顯著（P＞0．05），表明疫苗免疫對增重基本未產生影響。宰殺之前，第3組試驗雞體重增重明顯高于陽性對照組，差異顯著（P＜0．05），說明融合蛋白對E．tenella感染具有一定的抵抗作用。第3組與第1組體重差異顯著（P＜0．05），說明試驗組對E．tenella感染不能完全保護。

2．3 盲腸病變計分 盲腸病變計分統計情況如表3所示。由表3可看出各試驗組與陰性對照組的差異均顯著，第3組與第2組差異顯著，第3組的盲腸病變記分最小，為1．8，抗球蟲效果較好。

2．4 OPG值測定結果 33～36日齡各組雞的糞便卵囊計數（OPG）值測定結果見表4，由表4可以看出，試驗各組與陰性對照組比較差異均顯著，并且與陽性對照組差異顯著。其中第3組的OPG值最小為15 000，卵囊數量下降率最大，為40．78%。2．5 重組蛋白免疫對球蟲感染的綜合保護效果從表4可以看出，各組的ACI值，重組免疫毒素組較高，對雞體具有較好的保護效果。

表2 重組蛋白免疫對球蟲感染的增重效果的影響

表3 盲腸病變記分

表4 感染后5～9d各組雛雞的OPG值

表5 重組蛋白免疫對球蟲感染的保護效果

3 討論

雞球蟲病是雞常見且危害十分嚴重的寄生蟲病，是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。雛雞感染球蟲后，主要癥狀可見大量腸上皮細胞受損、出血，嚴重者造成死亡，病愈雞長期不能康復，生長及生產性能都受到嚴重影響。它造成的經濟損失是驚人的，是嚴重威脅著封閉式工廠化養雞發展的一種重要的疾病。近年來，多種球蟲保護性抗原基因被克隆表達，利用基因工程技術生產基因工程疫苗用于預防雞球蟲病越來越得到人們的重視。通過肌肉、鼻腔、靜脈、真皮、皮下及腹腔等不同接種途徑進行免疫，免疫效果表明，肌肉注射和靜脈注射效果最好。

本研究采用肌肉注射的方法是對14日齡雛雞進行首次胸腺部位免疫，21日齡進行加強免疫。在28日齡稱重后經口服感染1×105個E．tenella孢子化卵囊。36日齡宰殺所有雞只，根據雞只體內注射重組免疫毒素免疫后的盲腸病變記分、OPG、增重、結合抗球蟲指數（ACI）等相關抗球蟲感染指標檢測，試驗表明，重組蛋白可以顯著減少盲腸病變記分和卵囊排出，抑制增重減少，相對增重率和卵囊減少率是評價雞球蟲疫苗免疫保護效果的兩個重要的指標。不論應用藥物處理還是使用疫苗進行免疫后，其目的都是削減蟲卵卵囊的生成，使環境中的卵囊控制在非致病水平，因此目前以卵囊減少率作為

在雞球蟲病的免疫研究中評價保護效果的基本指標。結果顯示，免疫毒素組的卵囊減少率達到40．78%，而相對增重率明顯要比陽性對照組高。但免疫效果并不十分理想，飼養方式可能是一方面原因，地面平養雞的生活條件會使墊料變濕，卵囊孢子化容易再次被雞采食，造成再次感染；免疫間隔時間過短可能是另一方面原因，有研究成果表明，DNA疫苗必須進行多次加強免疫，但每次加強免疫間的間隔時間要相對較長［6］，Klotz等（2007）認為要獲得理想的保護效果間隔時間最好能達到3～4周［7］。綜合表明，重組免疫毒素對可誘導雞體產生一定的抗球蟲感染的免疫保護力。

［1］ ChaPman H D，Cherry T E，Danforth H D，Richards G，Shirley M W，Williams R B．Sustainable coccidiosis control in poultry production：the role of lives vaccines．Int J Parasitol，2002，32（5）：617－629．

［2］ 彭金彪．雞柔嫩艾美耳球蟲重組SO7抗原的免疫保護作用［D］．揚州：揚州大學，2007：5：64－65．

［3］ 王卉．雞柔嫩艾美耳球蟲楊凌株SO7和TA4抗原基因的克隆與表達及免疫保護性試驗［D］．楊凌：西北農林科技大學，2009：5：47－48．

［4］ 李安興，蔣金書．柔嫩艾美耳球蟲（Eimeriatenella）BJ株S07重組抗原的免疫試驗［J］．中國獸醫學報，2000，20（2）：167－170．

［5］ 彭維剛．雞柔嫩艾美耳球蟲楊凌株RB1－a基因的克隆表達與免疫保護性試驗［D］．楊凌：西北農林科技大學，2011，5：35．

［6］ 許金俊，陶建平，彭金彪，等．不同佐劑和免疫途徑對柔嫩艾美耳球蟲SO7抗原免疫保護效果的影響［J］．中國預防獸醫學報，2007，29（9）：702－703．

［7］ Klotz C，Gehre F，Lucius R，Pogonka T．Identification of Eimeria tenella genes encoding for secretory proteins and evaluation of candidates by DNA immunization studies in chickens［J］．Vaccine，2007，25（36）：6625－6634．