EMA－PCR檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法

趙素君，李江凌，謝 晶，曹 冶，王秋實，葉勇剛，羅丹丹，葉健強，廖黨金

（四川省畜牧科學研究院，四川 成都610066）

金黃色葡萄球菌（SA）是一種重要的人畜共患病病原，是引起細菌性食物中毒以及人和動物感染的重要病原菌之一。目前，細菌分離培養仍是金黃色葡萄球菌檢測的常規方法，該法雖然可靠，但耗時、費力不能滿足快速檢測的需要；而免疫學方法對各種致病因子的檢測，因毒素因子血清型復雜且同源性高，在檢測過程中難免出現血清型之間的交叉反應，導致假陽性，同時因檢測靈敏度低導致出現假陰性。總之，采用傳統的方法對該菌的檢測存在很大的局限。PCR技術以靈敏度高、特異性強、簡便和快速等優點被越來越多地應用于金黃色葡萄球菌的檢測中。

金黃色葡萄球菌能產生多種毒素和酶，其中由nuc基因編碼的耐熱核酸酶（Thermostable Nuclease，TNase），是一種侵襲性酶，能迅速分解核酸，利于病菌的擴散。nuc基因不僅為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性，因此，很多研究采用了nuc基因作為擴增的靶基因［1－4］。

傳統PCR技術無法區分樣品中的死菌與活菌，雖然死菌已經沒有危害性，但其DNA長期存在，死菌DNA在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結果出現大量的假陽性，干擾了檢測的真實性。疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一種熒光插入型的核酸結合染料，能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增；而完整未受損傷的活菌細胞膜能阻止EMA滲透，對活菌DNA不起作用［5－6］。本試驗將EMA與PCR技術結合，通過特異性擴增耐熱核酸酶編碼基因nuc基因，建立一種快速、有效的檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法。由于在檢測過程中除去了死細胞DNA對PCR的干擾，從而大大提高了檢測的準確性和真實性，為金黃色葡萄球菌病原檢測提出了一個全新的手段。

1 材料與方法

1．1 菌株 陽性菌株：金黃色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056；對照菌株：腸毒性大腸桿菌CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215，腸出血性大腸桿菌CVCC248，腸侵襲性大腸桿菌CVCC2072，腸致病性大腸桿菌CVCC251，沙門菌CVCC504，均購自中國獸醫藥品檢查所中國獸醫微生物菌種保存管理中心。

1．2 主要試劑 EMA為Biotium公司產品；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，購自TaKaRa公司；其他化學試劑均為國產分析純；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1．3 引物設計與合成 根據GenBank中金黃色葡萄球菌nuc基因序列設計引物如下，F：5′－TTAGCCAAGCCTTGACGAAC－3′；R：5′－AGGGCAATACGCAAAGAGGT－3′，擴增目的片段長度為480bp。

1．4 金黃色葡萄球菌活菌和死菌的制備 接種金黃色葡萄球菌CVCC3055，培養16h后，取1mL菌液于EP管中，6 000r／min（4℃）離心5min，收集菌體沉淀，加入無菌生理鹽水重懸沉淀，制成活菌懸液。再將活菌懸液72℃水浴15min，得到死菌懸液。

1．5 EMA處理 取適量菌懸液于EP管中，加入終濃度為100g／mL的EMA，在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理1min，光源放在離樣品管20cm處，光照時EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。EMA處理后的樣品，用于下面的DNA模板的制備。

1．6 模版DNA的制備 取1mL菌液，12 000r／min離心5min，去除上清液，然后用100μL滅菌去離子水重懸，然后100℃水浴5min后，再10 000r／min離心5min，上清液用作PCR檢測。

1．7 PCR反應體系及反應條件優化 PCR反應體系：10×ExTaqBuffer（含 MgCl2）2．5μL，dNTP mixture（各2．5mmol／L）2μL，引物（20μmol／L）各0．5μL，模板 DNA 1μL，TaKaRa ExTaq（5U／L）0．2L，滅菌雙蒸水加至25μL。

PCR反應條件優化主要通過退火溫度來實現，為了獲得特異性的擴增片段，采用Touchdown PCR方法確定PCR反應合適的退火溫度，設定退火溫度范圍65℃～45℃。擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．8 PCR特異性檢測 以CVCC3055、CVCC3056作為陽性菌株；以 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、 CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、CVCC251、CVCC504作為陰性對照，進行PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠成像系統進行觀察，出現特異性擴增條帶，即為檢測陽性，否則為陰性。

1．9 PCR靈敏度檢測 接種金黃色葡萄球菌CVCC3055，培養16h，取1mL菌液于EP管中，遞倍稀釋10－1～10－9，進行如上模板DNA制備，PCR檢測其靈敏度。同時，采用平板法進行細菌計數，通過牛肉膏蛋白胨瓊脂平板進行對照計數。分別取遞倍稀釋100～10－9的菌液50μL進行涂板，37℃過夜培養，然后分別進行計數，計算檢測靈敏度。

1．10 不同活細菌比例的混合菌懸液的EMA－PCR擴增 分別配制含有100%、75%、50%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0%的金黃色葡萄球菌CVCC3055活細菌菌懸液混合體系，分別加入終濃度為100μg／mL的EMA，在黑暗處放置5min后，樣品置于冰上用650W鹵素光源距離20cm處光照處理1 min，經EMA處理后的菌液，用于如上DNA模版的制備，進行PCR擴增。

2 結果

2．1 PCR反應條件的優化 經過Touchdown PCR方法確定最佳的PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃45s，28個循環；72℃延伸5min。

2．2 金黃色葡萄球菌nuc基因的PCR特異性檢測結果 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示（見圖1），只有金黃色葡萄球菌CVCC3055和CVCC3056擴增出480bp的目的條帶，DNA測序結果經BLAST分析，與GenBank上序列完全一致。而對照菌株 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、 CVCC251、CVCC504均未檢測到特異性條帶，結果為陰性。

2．3 金黃色葡萄球菌nuc基因的PCR檢測靈敏度分析 將各梯度稀釋液100～10－9分別進行nuc基因的PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，其靈敏度檢測低限為10－9，而相應的平板計數為15CFU／mL。

圖2 PCR檢測的靈敏性試驗

2．4 金黃色葡萄球菌EMA－PCR區分死菌與活菌的檢測結果 EMA－PCR擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示，除了全部是死菌的組外，其他含活菌各種比例的混合菌液中，均出現特異性擴增條帶，見圖3。

圖3 EMA－PCR對金黃色葡萄球菌活菌／死菌混合物的檢測

3 討論

金黃色葡萄球菌能產生多種毒素，主要有腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、剝脫毒素（ETs）和中毒休克毒素（TSST－1）等［7］。由于金黃色葡萄球菌的致病性主要與各種毒素有關，因此對各種毒素基因的檢測一直以來都是研究的熱點。目前，雖然金黃色葡萄球菌各種毒素的基因都已克隆并測序，人們可以根據各種毒素基因的保守和特異序列，設PCR引物，從而對金黃色葡萄球菌各種毒素直接進行PCR檢測，但不同菌株包含不同毒素基因，同一菌株也可包含多種腸毒素基因［8］，因其血清型復雜多樣在實際樣品的檢測中仍存在一定的局限性。從而選擇特異的靶基因在SA的PCR檢測中至關重要。本試驗選用由nuc基因編碼的耐熱核酸酶，作為鑒定金黃色葡萄球菌的重要指標。耐熱核酸酶是金黃色葡萄球菌產生的一種細胞外酶，能迅速分解核酸，利于病原菌的擴散。nuc基因作為擴增的靶基因具有較高的種屬特異性和保守性。

SA的檢測方法主要有分離培養法、瓊脂擴散法、免疫學檢測法、血清學及核酸探針檢測法，這些方法即費時費力，又易出現假陽性和假陰性，很難滿足快速檢測需要。PCR技術快速敏感、操作簡便，成為近年來病原菌鑒定研究的熱點。但在檢測中傳統PCR技術無法區分樣品中的死菌與活菌，死菌DNA在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結果出現大量的假陽性。本試驗采用EMA－PCR技術，利用EMA能穿過死菌的細胞膜并在光激活的作用下能與基因組DNA共價結合，從而能抑制死菌DNA進行PCR擴增的特性，通過特異性擴增nuc基因，建立了一種快速、有效的檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法。由于在檢測過程中通過EMA選擇性的與混合細菌菌落中的死菌DNA共價結合，除去死菌DNA的PCR干擾，從而使檢測結果準確、可靠，對金黃色葡萄球菌的檢測具有較好的應用價值，在臨床檢測上具有重要的意義。

［1］ Cattoir V，Merabet L，Djibo N，etal．Clinical impact of a realtime PCR assay for rapid identification of Staphylococcus aureus and determination of methicillin resistance from positive blood cultures［J］．Clin Microbiol Infect，2011，17：425－431．

［2］ He J，Zhu J，Chao G，Zhu X，etal．［Isolation and identification of a Staphylococcus aureus small colony variants［J］．Wei Sheng Wu Xue Bao，2009，49：1397－1402．

［3］ Pinto B，Chenoll E，Aznar R．Identification and typing of foodborne Staphylococcus aureus by PCR－based techniques［J］．Syst Appl Microbiol，2005，28：340－352．

［4］ Shittu A，Lin J，Morrison D．Molecular identification and characterization of mannitol－negative methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2007，57：93－95

［5］ Lee J L，Levin R E．A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets［J］．J Microbiol Methods，2009a，76：93－96．

［6］ Lee J L，Levin R E．Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA，sodium deoxycholate and real－time PCR［J］．J Microbiol Methods，2009b，79：184－188．

［7］ 傅丹青，陳棋炯，丁水軍，等．金黃色葡萄球菌腸毒素基因的檢測與分型［J］．中國衛生檢驗雜志，2011，21（5）：1167－1169．

［8］ 張鳳笑，石磊．PCR技術在金黃色葡萄球菌中的研究進展［J］．現代食品科技，2008，24（10）：1042－1047．