三黃雞ST6基因的半定量RT－PCR分析

周 飛，于 夢，劉榮昌，袁遠華，寧章勇

（1．華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510626）

唾液酸（Sialic acid，SA）是神經氨酸的衍生物，作為流感病毒的受體，唾液酸與流感病毒的血凝素（HA）相結合，介導流感病毒侵入機體的細胞。唾液酸以α2，3或α2，6鍵連接于聚糖或糖脂上，在流感病毒的侵入和流感的發生與發展中起著關鍵作用［1－2］。唾液酸是由唾液酸轉移酶以9－磷酸－N－乙酰神經氨酸或9－磷酸去氨基神經氨酸為底物催化而來的［3－5］，不同的亞型又對不同的糖鏈或脂鏈有相應的偏嗜性［6］。禽流感病毒偏嗜與SAα2，3Gal結合，人流感病毒偏嗜與SAα2，6Gal結合［7－9］，這一特點在很大程度上限制了流感病毒的跨物種傳播。此外，唾液酸還可以作為病原微生物逃逸宿主免疫系統的分子模擬器［9］。唾液酸轉移酶表達豐度的高低直接影響了唾液酸的分布與密度，所以唾液酸轉移酶的上調和下調對動物機體對流感病毒的感染及流感的發生與發展起著重要的作用。本文首次通過NCBI上已公布的雞的ST6序列設計了引物。通過RT－PCR克隆了雞的ST6GalⅠ序列和ST6GalⅡ序列，并檢測了ST6基因的表達譜。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 1月齡的三黃雞來自華南農業大學獸醫院禽病教研室，經檢測未見禽流感的感染。處死后取其心，肝，脾，肺，腎，腦，腔上囊，胸腺組織。組織樣品凍存于液氮中，用于總RNA的提取。

1．2 總RNA的提取 取液氮中的組織樣品150 mg，在液氮中研碎后，用Trizol法提取總RNA。溶于無RNA酶的水中，－80℃保存備用。

1．3 逆轉錄反應 逆轉錄RT反應的具體過程參照逆轉錄試劑盒說明書進行，逆轉錄RT反應的總體系為20μL。逆轉錄出的cDNA放于－80°保存備用。

1．4 半定量RT－PCR 半定量RT－PCR的內參基因為雞的β－actin基因（登錄號：NM＿205518）。上游引物為5′－GAGGCTACAGCTTCACCACCACA－3′，下游引物為：5′－CCACAGGACTCCA TACCCAAGAA－3′，擴增基因片段長度為232bp，退火溫度：59℃。用于半定量ST6GalⅠ（登錄號：NM＿205241）的上游引物為：5′－GTGAAATGGGTCAGATGCCTAAA－3′，下游引物為：5′－CCATTAAACCGCAAGACAGCATC－3′，擴增長度為463 bp，退火溫度：56℃；ST6GalⅡ（登錄號：NM＿001167747）的上游引物為：5′－TGAGGAGAAGGAGCACAAAGC ACAG－3′，下游引物為：5′－CCAGCAGACATAACTACGGCACAGC－3′，擴增長度為391bp，退火溫度：55℃。其中β－actin和ST6的反應擴增體系都為25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL ，dNTPs 2μL（各2．5mmol／L），上游引物和下游引物各1μL（20μmol／L），0．2μL ExTaq酶（5U／L－），模板cDNA 2．5μL，超純水15．8μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性10min；94℃ 變性30s；52℃退火40s；72℃延伸40s，經過一定循環數后與72℃總延伸10min；－20℃保存。其中反應循環數采用28、29、30、31、32、33、34、35個［10］共8個不同循環數擴增ST6和β－actin基因，篩選用于半定量的最適反應循環數。反應產物用2%瓊脂糖凝膠進行檢測照相，半定量分析軟件用Gel－Proanalyzer 4 進行，計算 ST6 與 β－actin 的比值，比值表示目的基因的相對表達量。

2 結果與分析

利用ST6特異性引物擴增出的產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，所擴增的ST6基因和β－actin基因片段的大小與預期的相符，測序結果顯示所克隆的片段為三黃雞ST6基因和β－actin基因片段。

最佳循環數檢測結果顯示，ST6和β－actin基因在28～35循環數之間均出現目的條帶且基因產量呈線性擴增，沒有進入平臺期。為了獲得理想的試驗結果，將試驗中ST6和β－actin的半定量PCR循環數優化為33個循環（圖1和圖2）。

取等量不同組織的總RNA，經過RT－PCR 33個循環擴增。經 Gel－Proanalyzer 4分析后表明，ST6基因在三黃雞的8個組織中均有表達，其中ST6GalⅠ在心臟中表達最高，腦中最低；ST6GalⅡ在胸腺中表達最高，在肝臟中表達最低，而ST6GalⅠ在各組織中的表達比其相應組織中的ST6GalⅡ的表達要低（圖2）。

3 討論

作為糖基轉移酶成員之一的唾液酸轉移酶，在唾液酸的合成中起著重要作用。ST6主要催化α2，6唾液酸的合成，且其偏嗜使Ⅱ型聚糖鏈（Galβ1，4GlcNAc2R）唾液酸化，唾液酸轉移酶在組織中的豐度直接影響著唾液酸在不同組織中的分布。

本研究根據GenBank上的ST6所公布的序列，設計引物，成功對三黃雞ST6GalⅠ和ST6GalⅡ基因進行了組織表達譜的分析，結果發現ST6基因在心、肝、脾、肺、腎、腦、腔上囊、胸腺這8種組織中都有表達，ST6GalⅠ在心表達量最高，在腦表達最低，其表達量從高到底依次為：心、脾、肝、胸腺、腎、腔上囊、肺、腦；ST6GalⅡ在胸腺表達量最高，在肝表達最低，其表達量從高到底依次為：胸腺、腔上囊、肺、腎、脾、腦、心、肝。Smitha PS Pillai，馬明［11－12］等人通過免疫組織化學法檢查到SAα2，6Gal在雞各組織中的分布，本研究的結果與其相似。本研究在mRNA水平上證實了ST6的表達，至于SAα2，6Gal是由ST6GalⅠ還是ST6GalⅡ亦或是由兩種酶同時催化而成的，還需要進一步研究。

由于唾液酸是流感病毒侵入機體的受體，而唾液酸轉移酶又是催化唾液酸和糖鏈合成的關鍵酶，所以曹文雁［13］、van Wielink R［14］等人通過提高唾液酸轉移酶的表達豐度，從而提高了細胞培養流感病毒的滴度。所以本研究對ST6基因的兩個亞型在各組織間表達豐度進行了比較，為流感病毒入侵細胞機制的研究和發展受體依賴性流感病毒細胞培養技術提供了基礎數據。

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