2007年～2010年H9N2亞型禽流感病毒分離株對SPF雞的致病特性研究

王守春，張 毅，盧春曉，王曉紅，徐守振，王建琳，李海英，周 順，王 光，郭妍妍，畢玉海，尹燕博

（1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島266109；2．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081；3．青島即墨市畜牧獸醫(yī)局，山東 青島266200；4．中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 海淀100101）

H9N2亞型禽流感病毒在1966年的美國威斯康辛州一個火雞養(yǎng)殖場中首次被分離到，目前已在全世界范圍內(nèi)廣泛地流行。該亞型禽流感病毒在我國1994年首次被報道，現(xiàn)今已成為我國禽類養(yǎng)殖中，危害較大的一種傳染病。H9N2病毒為低致病性禽流感病毒，在養(yǎng)殖環(huán)境下可引起家禽呼吸困難、腹瀉、產(chǎn)蛋下降等癥狀，當(dāng)繼發(fā)細菌感染時可引起較高的死亡率；而在試驗狀態(tài)下，H9N2亞型禽流感病毒通常不能引起SPF雞明顯的癥狀和組織病變［1－3］。我們統(tǒng)計分析了本實驗室2007年～2010年間分離的H9N2亞型禽流感病毒的雞胚平均死亡時間（MDT），發(fā)現(xiàn)2008年下半年以來，部分H9N2病毒分離株的MDT顯著地小于早期分離的毒株，數(shù)據(jù)說明這些毒株對SPF雞胚的致病力更強。而這些毒株對SPF雞的致病性是否增強，還不得而知，為了研究這些H9N2分離株對SPF雞的致病特性，我們選擇了MDT在60．5～96．3h之間的9株H9N2亞型病毒，測定了這些毒株的致病指數(shù)（IVPI），以及在SPF雞體內(nèi)的復(fù)制和排毒情況。試驗結(jié)果表明，2008年以后分離的一部分H9N2亞型病毒增強了對SPF雞的致病性。

1 材料與方法

1．1 病毒的分離與鑒定 9株病毒均由本實驗室采集拭子或病料，通過接種10日齡SPF雞胚分離，并經(jīng)HI和NI試驗鑒定病毒的亞型。

1．2 病毒的雞胚半數(shù)感染量（EID50）及雞胚平均致死時間（MDT）的測定 用無菌PBS對病毒進行連續(xù)10倍稀釋，按照OIE規(guī)定的方法［4］，接種10日齡SPF雞胚測定病毒的EID50及 MDT，并利用Reed－Mueneh法進行計算［5］。

1．3 病毒的雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）測定 將病毒液用無菌PBS作10倍稀釋，按每只雞0．1mL的劑量，翅下靜脈接種10只6周齡SPF雞，觀察癥狀及死亡情況，并記錄發(fā)病時間與死亡時間，連續(xù)觀察10d，按照OIE規(guī)定的方法計算IVPI［4］。

1．4 SPF雞人工感染排毒試驗 將病毒液用無菌的PBS稀釋至107EID50／mL，靜脈接種6周齡SPF雞，每組13只，每只0．2mL，病毒接種后第3天，第5天和第7天采集7只攻毒雞的喉頭及泄殖腔拭子，采集的拭子做無菌處理后，接種SPF雞胚，每個拭子接種5枚，37℃孵育72h，測定雞胚尿囊液的HA效價，同一拭子接種的3枚雞胚中之一HA效價大于24即判定為病毒分離陽性。

1．5 感染雞的病毒組織臟器分布及載量 病毒接種后第3天和第5天每組各剖檢3只雞，取氣管、肺、腎、腦和十二指腸，然后稱量各個組織臟器的重量，加10倍體積的PBS，無菌研磨勻漿，3 000r／min離心10min，取上清液接種10日齡SPF雞胚測定各組織臟器中的病毒載量。

2 結(jié)果

2．1 H9N2分離株對雞胚的致病力 9株H9N2亞型禽流感病毒EID50，半數(shù)致死量（ELD50），MDT測定結(jié)果見表1。

表1 EID50，ELD50，MDT和IVPI測定

由表1可以看出，這9個H9N2亞型分離株對雞胚的致病力差異較大，從各項指標(biāo)來看，CK／SD／827／09在雞胚中的增殖能力最強，其EID50可達到10－9／0．1mL，而且其對雞胚的致病力也最強，其MDT值可達到60．5h。

2．2 H9N2分離株對SPF雞的致病力 為了測定這些H9N2分離株對SPF雞的致病力，我們對各分離株的IVPI進行了測定。從表1的數(shù)據(jù)中可以看出，所有的這些H9N2分離株的IVPI值均未達到高致病性禽流感毒株的標(biāo)準(zhǔn)，盡管如此，不同毒株對SPF雞的致病力還是存在明顯的差異。在接種CK／SD／lx1023／07病毒后，所有的SPF雞均未出現(xiàn)任何臨床癥狀，與對照組相比無明顯差異。而在CK／SD／827／09毒株的接種組，在接種后的2～5d，個別雞表現(xiàn)出精神沉郁，縮頭閉眼的情況，另有個別雞出現(xiàn)下痢，并且整體出現(xiàn)食欲下降，但并沒有雞死亡。IVPI和接種后的臨床癥狀觀察表明，這些H9N2病毒分離株對SPF雞的致病力存在一定的差異，且這種差異與其對雞胚的致病力存在相關(guān)性。

2．3 H9N2分離株在SPF雞體內(nèi)的分布和復(fù)制能力不同的H9N2分離株對SPF雞表現(xiàn)出不同的致病性，為了驗證這種致病力的差異是否是由于其在雞體內(nèi)的復(fù)制能力差異引起的，我們測定了病毒在雞體內(nèi)的分布和各個組織器官的病毒載量。見表2。

從表2中我們可以觀察到，對SPF雞致病力強的毒株其在雞體內(nèi)的分布要比致病力低的毒株更廣泛，其中 A／CK／SD／827／09 和 A／CK／LN／103／10是對SPF雞IVPI指數(shù)最高的兩個毒株，這兩個毒株在測定的肺、氣管、腦、腎和十二指腸全部可以分離到，而對SPF雞IVPI指數(shù)最低的 A／CK／SD／lx1023／07，只能在攻毒后3d的氣管中分離到病毒。這說明H9N2毒株間的致病性差異與病毒在體內(nèi)的擴散存在聯(lián)系，強致病性的毒株比致病力較弱的毒株具有更廣泛的組織嗜性。從病毒的復(fù)制情況來看，對SPF雞致病力強的毒株在雞體內(nèi)各個組織器官的復(fù)制能力要更強，其中 A／CK／SD／827／09和A／CK／LN／103／10這兩個毒株幾乎在各個組織器官中的復(fù)制能力都是最強的，而且對SPF雞的致病力也是最強的。這說明病毒的復(fù)制能力與病毒對SPF雞的致病性呈正相關(guān)性。

表2 攻毒后H9N2病毒在雞臟器中的復(fù)制

2．4 H9N2分離株在攻毒后的排毒情況 因為H9N2病毒在雞群中的傳播與感染雞的排毒情況有直接的聯(lián)系，所以我們測定了感染雞在口腔和泄殖腔的排毒情況。見表3。

表3 H9N2病毒攻毒雞排毒情況

表3的數(shù)據(jù)表明，在感染后的第3天，所有的攻毒組均存在排毒的情況，而對雞致病力強的毒株可以造成更高比例的感染雞排毒。而在感染后的第7天，只有對雞致病力較強的毒株，例如A／CK／SD／827／09和A／CK／LN／103／10等攻毒組，存在感染雞的排毒，而且排毒雞的比例也與病毒致病力呈正相關(guān)。

3 討論

雖然H9N2亞型流感病毒并非高致病性流感病毒，但由于其流行范圍廣，流行時間長，因此給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。為了控制和預(yù)防H9N2亞型流感病毒，我國的養(yǎng)殖場從1998年左右即開始使用H9N2亞型流感病毒滅活疫苗［6］。雖然疫苗的使用對H9N2病毒的防控起到了一定的效果，但是由于免疫壓力的普遍存在，流感病毒的進化和變異比以往更加迅速，新的變異株不斷地出現(xiàn)［7］，而且在水禽，鵪鶉，鴨和豬等宿主中，H9N2亞型流感病毒與其他亞型流感病毒的混合感染，導(dǎo)致重排病毒不斷地出現(xiàn)［6，8－9］。對于新出現(xiàn)的流感病毒的監(jiān)測，是流感防控工作非常重要的環(huán)節(jié)，而且具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。在前面的研究中，我們及其他學(xué)者對于H9N2病毒在我國的進化和變異進行了詳細地報道［9－10］，而對于流行毒株的致病性卻缺乏系統(tǒng)的研究。在本試驗中，我們對近期在我國分離到的H9N2毒株對SPF雞的致病特性進行了研究和比較。

本研究發(fā)現(xiàn)2007年～2010年在我國流行的H9N2毒株對SPF雞的致病性存在一定的差異，部分毒株對SPF雞呈現(xiàn)較強的致病力，這可能是由于這些毒株在雞體內(nèi)的系統(tǒng)性感染，和較高的復(fù)制能力。由于病毒的傳播與擴散與雞群在感染后的排毒相關(guān)，所以我們測定了這些H9N2毒株在感染后的排毒情況，數(shù)據(jù)表明，對SPF雞呈現(xiàn)較高致病力的毒株在口腔和泄殖腔的排毒能力也較強，這表現(xiàn)在感染雞排毒的比例較高，而且排毒時間較長。H9N2病毒在感染后的排毒能力可能與其在雞體內(nèi)的復(fù)制能力相關(guān)。在以前的研究中，H9N2病毒接種SPF雞一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，毒株對SPF雞沒有明顯的致病性［1］。而在本試驗中，2008年以后分離的部分的H9N2毒株在接種SPF雞以后，卻表現(xiàn)出一定的致病力，而且這些毒株相比致病力較弱的毒株，感染SPF雞后排毒能力更強。這些情況說明H9N2病毒在基因組變異和進化的過程中，可能獲得了某些對致病性產(chǎn)生影響的突變或重排方式，這需要在以后的研究中加以證明。

H9N2亞型流感病毒在存在廣泛免疫壓力的條件下，在雞群中不斷地進化，新的抗原變異株或毒力變異株可能會不斷地出現(xiàn)，所以我們應(yīng)該繼續(xù)對H9N2亞型流感病毒給予充分的關(guān)注，不僅僅要關(guān)注毒株基因的進化，而且還應(yīng)該注意其毒力的變異，研究病毒致病力變化的機理，開發(fā)針對新變異株的疫苗，為H9N2亞型禽流感的防控奠定堅實的基礎(chǔ)。

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