川藏高原威代爾冰葡萄中酵母菌的分離、篩選及其耐受性研究

張麗珠，邢亞閣，許青蓮，盧 靖，車振明*，羅建峰

（1.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川 阿壩藏族羌族自治州 623104）

冰葡萄酒是利用在-7℃以下，在葡萄樹上自然冷凍和風(fēng)干的葡萄釀造的葡萄酒。冰葡萄果實(shí)中的糖分及其他內(nèi)容物得到高度濃縮[1-2]，可獲得高品質(zhì)的葡萄原料釀造出品質(zhì)優(yōu)異的葡萄酒。葡萄酒的釀造是通過酵母菌的作用，將葡萄原料中糖轉(zhuǎn)化為酒精[3]。優(yōu)良葡萄酒酵母應(yīng)具有生長速率快、耐高糖、耐SO2、發(fā)酵平穩(wěn)、酒精產(chǎn)率高、發(fā)酵完全等特性[4]。目前，我國葡萄酒的生產(chǎn)主要是自然發(fā)酵或者引進(jìn)國外活性干酵母接種發(fā)酵，自然發(fā)酵最大可能的保留了產(chǎn)地葡萄的品質(zhì)和特色，但是存在發(fā)酵過程不易受控制、發(fā)酵周期長且酒品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)；而大量引進(jìn)國外活性干酵母接種發(fā)酵，造成了國內(nèi)葡萄酒口味的趨同化[5]，制約了具有中國地域特色葡萄酒的生產(chǎn)。從產(chǎn)地葡萄中篩選出適合本地區(qū)葡萄酒發(fā)酵的酵母菌，不僅可以解決自然發(fā)酵中存在的問題，還能釀造具有地區(qū)特色的優(yōu)質(zhì)葡萄酒。

從種植于四川阿壩的威代爾冰葡萄中分離出酵母菌，將其純化后，初篩出產(chǎn)氣能力和產(chǎn)醇能力優(yōu)異的酵母，并研究其耐受性試驗(yàn)，旨在篩選出適合四川阿壩地區(qū)特色冰葡萄酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

威代爾冰葡萄：塔斯酒莊提供；酒石酸、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）、乙醇、甘油：成都科龍化工試劑廠；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、孟加拉紅培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：市售成品，按說明比例加水，121℃滅菌2min。

麥芽汁培養(yǎng)基：市售成品，按說明比例加水，115℃滅菌15min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉1g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，固體培養(yǎng)基添加15g瓊脂粉。

TTC上層培養(yǎng)基[6]：葡萄糖5g，TTC 0.5g，瓊脂粉15g，水1000mL，pH 6.0，加熱溶解。

WL培養(yǎng)基[7]：酵母浸粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，磷酸二氫鉀0.55g，氯化鉀0.425g，氯化鈣0.125g，硫酸鎂0.125g，氯化鎂0.0025g，硫酸錳0.0025g，瓊脂15g，溴甲酚綠0.022g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器公司；pHS-25精密pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠；721分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化

稀釋涂布分離：威代爾冰葡萄壓榨后清液備用，在無菌操作下將壓榨后的清液稀釋成10-2、l0-3、l0-4倍的稀釋液，取0.1mL涂布于孟加拉紅平板，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

劃線純化：選取菌落均勻的平板，無菌操作下挑取單菌落于孟加拉紅培養(yǎng)基上劃線純化。

1.2.2 菌種保存

將純化后的酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中于30℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，將菌液與50%vol甘油（121℃滅菌20min）按照1∶1混合后置于-4℃保存，備用。

1.2.3 酵母菌的初篩

1.酵母菌的產(chǎn)氣能力實(shí)驗(yàn)[8-9]

采用杜氏管發(fā)酵法，用麥芽汁液體培養(yǎng)基注滿杜氏管，將其倒置于裝有10mL麥芽汁培養(yǎng)基的試管中，115℃滅菌15min。在無菌操作下接種活化后菌數(shù)達(dá)106CFU/mL的菌源0.1mL。將其置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h記錄其在杜氏管中氣泡占其體積的多少，直至杜氏小管內(nèi)的氣體體積不再變化。

2.酵母菌的產(chǎn)醇能力實(shí)驗(yàn)[10-11]

取活化后菌數(shù)達(dá)到106CFU/mL的菌源進(jìn)行梯度稀釋，取l0-3、l0-4和10-53個(gè)梯度的稀釋液0.1mL涂布于YPD固體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株每個(gè)梯度各做3個(gè)平行。將其倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出可見菌落后，選擇菌落數(shù)為100～300的平板倒入約15mL TTC上層培養(yǎng)基，使其均勻覆蓋原來菌落。并將其置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3h，并記錄菌落的呈色（3個(gè)平行樣中至少有2個(gè)呈色一致方能記錄）。

1.2.4 WL培養(yǎng)基鑒定酵母菌[7，12-13]

將分離得到的酵母菌劃線接種于WL營養(yǎng)培養(yǎng)基，于霉菌培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)5d后觀察，記錄菌落顏色和形態(tài)。

1.2.5 酵母菌的耐受性實(shí)驗(yàn)

耐溫性實(shí)驗(yàn)：將活化后菌數(shù)達(dá)106CFU/mL的菌源0.2mL接種于10mLYPD液體培養(yǎng)基中，然后分別置于15℃、25℃、30℃和35℃培養(yǎng)24h，在波長600nm下測(cè)定其吸光度值。耐乙醇、耐酸、耐糖、耐SO2實(shí)驗(yàn)：采用不同乙醇濃度體積分?jǐn)?shù)（4%、8%、12%、16%）、酒石酸質(zhì)量濃度（8%、10%、15%、20%）、葡萄糖質(zhì)量濃度（10%、20%、25%、30%）、SO2質(zhì)量濃度（100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L）的YPD液體培養(yǎng)基10mL，分別接種活化后菌數(shù)達(dá)106CFU/mL的菌液0.2mL，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在波長600nm下測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果分析

2.1 酵母的初篩

威代爾冰葡萄中分離得到24株酵母菌，將這24株酵母菌分別標(biāo)號(hào)為V1、V2、V3…V24。

2.1.1 酵母菌的產(chǎn)氣能力

將從威代爾冰葡萄中分離得到的24株酵母菌分別接種于含有杜氏管的麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其產(chǎn)氣能力結(jié)果如表1所示。

表1 酵母菌的產(chǎn)氣能力結(jié)果Table 1 Results of gas production ability of yeasts

由表1可知，在36h時(shí)24株酵母產(chǎn)氣均達(dá)到杜氏小管滿體積，并且有7株酵母菌在最初的12h時(shí)產(chǎn)氣已達(dá)到杜氏小管滿體積，說明從威代爾冰葡萄中分離出的酵母菌發(fā)酵能力較強(qiáng)，有較高發(fā)酵效率。

2.1.2 酵母菌的產(chǎn)醇能力

從威代爾冰葡萄中分離得到的24株酵母菌的產(chǎn)醇能力如表2所示。將分離得到的24株酵母菌在YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成的酵母菌落上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基。通過TTC顯色劑對(duì)酵母代謝產(chǎn)物的呈色特性，篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母，篩選得到的酵母，其生長旺盛，同步性好，發(fā)酵能力強(qiáng)，接種后能較快地進(jìn)入主發(fā)酵期[14]。在TTC上層培養(yǎng)基覆蓋下，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌落呈深紅色，次之為粉紅色[15]。由表2可知，TTC平板呈深紅色的酵母菌有5株，呈粉紅色的酵母菌有13株，呈微紅色的有6株。

在葡萄酒的釀造過程中，酵母菌利用葡萄汁中的糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精與CO2（C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2↑）。通過產(chǎn)氣及產(chǎn)醇試驗(yàn)初篩出4株具有較強(qiáng)產(chǎn)氣、產(chǎn)醇能力的菌株，分別為V1、V5、V9、V14。

表2 酵母菌的產(chǎn)醇能力結(jié)果Table 2 Results of alcohol production ability of yeasts

2.2 WL營養(yǎng)培養(yǎng)基鑒定酵母菌結(jié)果

CAVAZZA A等[16]研究表明，在葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型的酵母菌種都可以用WL營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分，主要基于菌落顏色及菌落形態(tài)。將初篩出的5株酵母菌經(jīng)WL營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，均為奶油色帶綠色，突起、表面光滑、不透明、奶油狀，WL營養(yǎng)培養(yǎng)基鑒定結(jié)果表明，V1、V5、V9、V14這4株酵母菌均為釀酒酵母。

2.3 酵母菌耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酵母菌的溫度耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

冰葡萄酒的發(fā)酵溫度一般在14℃～16℃，使冰葡萄酒能在低溫下進(jìn)行緩慢長時(shí)間發(fā)酵，以釀造出高品質(zhì)的冰葡萄酒。將初篩得到的4株酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基在不同的溫度下培養(yǎng)24h后，在波長600nm處測(cè)定吸光度值，其結(jié)果見圖1。由圖1可知，4株酵母菌隨著溫度的升高，酵母菌的生長情況好轉(zhuǎn)，而當(dāng)溫度超過30℃后，其生長情況有所降低。在15℃時(shí)，V5、V9的生長情況均好于對(duì)照葡萄酒酵母，說明V5、V9能耐受較高溫度。

2.3.2 酵母菌的酸性耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將初篩出的4株酵母菌及對(duì)照葡萄酒酵母接種于不同酒石酸含量的YPD培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24h后，在波長600nm測(cè)定吸光度值，其結(jié)果見圖2。酒石酸是葡萄汁中主要的有機(jī)酸，測(cè)定分離酵母的耐酸性主要考察其對(duì)耐酒石酸的耐受能力。圖2結(jié)果表明，V9及V14在不同的酒石酸含量中的YPD培養(yǎng)基中生長情況均好于對(duì)照葡萄酒酵母，其中V9在酒石酸含量≥15.0g/L時(shí)其生長情況較其他酵母菌株好。

圖2 不同酒石酸含量對(duì)酵母菌生長情況的影響Fig.2 Effect of different acid concentration on the growth of yeasts

2.3.3 酵母菌的糖度耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3可以看出，4株酵母菌隨著培養(yǎng)基中含糖量的增加，其吸光度值隨之下降，可能是因?yàn)檫^高的糖含量抑制了酵母菌的生長。當(dāng)葡萄糖含量從10%上升至20%時(shí)，V1和V14的吸光度值下降幅度較其他3株菌明顯；而含糖量在2%以上時(shí)，酵母菌株V14的吸光度值幾乎接近零點(diǎn)，表明V14在較高糖含量的培養(yǎng)基中基本不生長；其他3株酵母均較對(duì)照葡萄酒酵母耐糖性高。

圖3 不同葡萄糖含量對(duì)酵母菌生長情況的影響Fig.3 Effect of different glucose levels on the growth of yeasts

2.3.4 酵母菌的酒精度耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 不同乙醇含量對(duì)酵母菌生長情況的影響Fig.4 Effect of different alcohol concentration on the growth of yeasts

4株酵母菌的酒精度耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4所示，葡萄酒的酒精度一般在8%vol～12%vol間，這是由于酒精度過高時(shí)，酵母菌即停止生長。由圖4可知，在不同的酒精度含量的培養(yǎng)基中，酵母菌的變化趨勢(shì)基本一致，即隨著酒精度的增加其吸光度值下降，V5、V14兩株酵母菌在含酒精的培養(yǎng)基中生長均緩慢，這表明這兩株菌的耐酒精性能較其他3株酵母菌差。V1、V9與對(duì)照葡萄酒酵母有相似的耐酒精性能。

2.3.5 酵母菌的SO2耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4株酵母菌的SO2耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5所示。葡萄酒生產(chǎn)過程中，需加入適量的SO2，以達(dá)到抑制有害微生物、抗氧化、護(hù)色等作用[5]，優(yōu)良葡萄酒酵母要確保能在一定的SO2濃度下正常發(fā)酵。由圖5可知，4株酵母菌與對(duì)照葡萄酵母的吸光度值均隨著SO2濃度的增加先下降，然后基本維持在一穩(wěn)定范圍內(nèi)。當(dāng)SO2含量高于150mg/L時(shí)，4株酵母菌的生長情況相差不大，其生長情況均優(yōu)于對(duì)照葡萄酒酵母菌，表明其具有一定的耐SO2性能。

圖5 不同SO2含量對(duì)酵母菌生長情況的影響Fig.5 Effect of different SO2concentration on the growth of yeasts

3 結(jié)論

將威代爾冰葡萄中的酵母菌進(jìn)行分離純化后，通過酵母菌的產(chǎn)氣能力實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)醇能力實(shí)驗(yàn)初篩出4株產(chǎn)氣及產(chǎn)醇能力優(yōu)良的酵母菌，并通過WL營養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別初篩出的4株酵母均為釀酒酵母。對(duì)將4株釀酒酵母與對(duì)照葡萄酒酵母進(jìn)行耐溫、耐酸、耐乙醇、耐糖和耐SO2實(shí)驗(yàn)，綜合考慮其對(duì)溫度、酸度、酒精度、糖度和SO2耐受性，分離得到的菌株V9具有良好發(fā)酵性能，具有阿壩地區(qū)特色冰葡萄酒的發(fā)酵潛能。對(duì)于所篩選酵母的分子生物學(xué)鑒定及其性能的穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。

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