酶氧化雞脂制備雞肉味香料前體物

袁雪芬，張智海，朱 凱*

（南京林業(yè)大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037）

肉香味形成的主要前體物包括2大類：水溶性物質和脂質[1]。水溶性物質主要形成肉類的一般性風味，而脂質則是形成不同肉類特征性風味的主要物質。很多研究表明[2-4]，在肉類烹調過程中，是由美拉德反應、脂質氧化降解反應及兩者之間的相互作用反應共同形成了濃郁的肉香味。

早前，關于還原糖和氨基酸反應直接制備肉味香料的研究很多[5-6]，關于植物油脂氧化制備香味料的報道也較多[7]，而關于脂肪氧化降解對肉味香料的貢獻的研究卻相對較少。脂質在氧化過程中，不飽和脂肪酸與氧發(fā)生自由基鏈反應生成氫過氧化物，氫過氧化物雖無色無味，但進一步降解可形成醛類、酮類等具有芳香性氣味的小分子物質，并且可與美拉德反應相互作用，改變其反應途徑，產生一些特征性香味物質[8-9]。普通的脂肪氧化途徑有兩種：自氧化和加熱氧化。自氧化一般是酸敗的表現(xiàn)，而加熱氧化需要的溫度相對較高。研究發(fā)現(xiàn)，大豆等植物中存在的脂肪氧合酶能專一催化含有cis，cis-1，4戊二烯結構的直鏈脂肪酸、脂肪酸酯和醇，通過分子內加氧反應形成含有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物[10-12]。以酶催化脂肪氧化，不僅反應條件溫和且反應過程綠色無污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞脂：南京華揚香精香料實業(yè)有限公司；大豆：市場購買；亞油酸：阿拉丁試劑公司；石油醚：無錫市亞盛化工有限公司；碘化鉀：國藥集團化學試劑有限公司；異辛烷：上海凌峰化學試劑有限公司；硫代硫酸鈉：上海久億化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHJF-4002型低溫恒溫反應攪拌?。亨嵵菔锌乒べQ有限公司；XDW600XZ-65L無油空氣壓縮機：浙江省磐安工業(yè)園區(qū)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪氧合酶提取[13-14]

將大豆粉碎后40目過篩，經石油醚（沸程60℃～90℃）浸提2h，得脫脂豆粉。每批次取20g脫脂大豆粉，加入200mL蒸餾水，室溫條件下攪拌浸提1h，再由離心機在常溫5000r/min條件下離心25min，得脂肪氧合酶粗酶液。

1.3.2 雞脂氧化方法測定[15]

在裝有電動攪拌器、溫度計、導氣管及回流冷凝管的四口燒瓶中加入一定量的雞脂、硼酸鹽緩沖液及脂肪氧合酶粗酶液，通入壓縮空氣，反應一定時間后，取上層雞脂，測定其過氧化值。

1.3.3 酶活測定方法[13，16]

酶活定義：在25℃，pH值為9.0，以亞油酸為反應底物，以1min內3mL反應體系在波長234nm處的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位。

底物配制：在10mLpH值為9的硼酸鹽緩沖液（0.2mol/L）中，加入0.25mL吐溫-20，混合均勻，再逐滴加入0.27mL亞油酸，充分混合。加入1mol/L氫氧化鈉溶液使體系澄清，用1mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至9，然后將該溶液稀釋至500mL。

分光光度法測定吸光度：取0.2mL粗酶液（已稀釋一定倍數(shù)）移入25℃，1.5mL的底物溶液中，混合均勻后于25℃的恒溫水浴中保溫3min。用5mL無水乙醇終止反應，加入5mL蒸餾水，混合均勻后于波長234nm處測定反應液吸光度值。空白為0.2mL粗酶液中加入5mL無水乙醇，再加1.5mL底物溶液，于25℃保溫3min，然后加入5mL蒸餾水。

1.3.4 過氧化值測定方法

過氧化值測定方法參見國家標準GB/T5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》。

2 結果與分析

2.1 時間對氧化反應的影響

圖1 反應時間對氧化反應的影響Fig 1 Effect of reaction time on the oxidation reaction

由圖1可知，過氧化值隨著反應時間的延長而增加，于5h后趨于平緩，因此5h為較合適的反應時間。反應開始初期，反應時間越長，氧化反應進行的越充分，當反應完全之后，隨著時間的增加，過氧化值不再變化。

2.2 溫度對氧化反應的影響

圖2 反應溫度對氧化反應的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the oxidation reaction

由圖2可知，脂質的過氧化值隨著溫度的降低而降低，說明大豆脂肪氧合酶在較低溫度下反應活性較高，而溫度太低時脂肪凝固，不易反應進行，故低于10℃時，過氧化值較低，10℃時，過氧化值最高，故宜選取10℃作為反應溫度。

2.3 底物濃度對氧化反應的影響

圖3 底物濃度對氧化反應的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the oxidation reaction

由圖3可知，隨著底物質量濃度的增加，過氧化值也呈增加的趨勢，當?shù)孜镔|量濃度約為225g/L時，氧化產物的過氧化值最高。因為隨著底物質量濃度的增加，傳質面積增大，反應進行的更加完全。當?shù)孜镔|量濃度繼續(xù)增大時，可能對反應產生了抑制作用，過氧化值隨之降低。故底物質量濃度為225g/L時為反應較好的選擇。

2.4 pH值對氧化反應的影響

圖4 pH值對氧化反應的影響Fig.4 Effect of pH value on the oxidation reaction

由圖4可知，隨著pH值的增大，產物過氧化值增加，當pH值為9時，氧化產物的過氧化值最高，之后隨著pH值得增大，過氧化值下降。故pH值為9為反應的較佳選擇。

2.5 空氣流速對氧化反應的影響

由圖5可知，空氣流速為0.2m3/h時，反應產物的過氧化值最大。故空氣流速為0.2m3/h為反應的較佳選擇。

2.6 脂肪氧化反應條件優(yōu)化

以氧化反應時間、反應溫度、底物濃度，pH值及空氣流速5個因素設計正交試驗，以確定酶催化脂肪氧化的最佳反應條件。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

圖5 空氣流速對氧化反應的影響Fig.5 Effect of air velocity on the oxidation reaction

表1 氧化反應條件優(yōu)化正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for oxidation reaction condition optimization

表2 氧化反應條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for oxidation reaction condition optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，5個因素對氧化反應的影響順序是：反應溫度＞底物濃度＞反應時間＞pH值＞空氣流速。其中氧化溫度是最重要的影響因素。由表3可知，A和D因素的F比均大于1，說明這兩個因素對試驗結果影響較為顯著，是主要影響因素，B、C、E因素為次要影響因素。綜合分析，得到較高過氧化值氧化產物的最優(yōu)氧化反應條件組合為A1B4C2D3E3，即反應溫度10℃，反應時間5h，底物濃度225g/L，pH值為9，空氣流速0.2m3/h。經3次驗證度驗結果表明，在此最佳條件下，反應產物過氧化值可達180mmol/kg脂肪。

3 結論

單因素及正交試驗的結果表明，氧化溫度對反應的結果影響最大，空氣流速對反應結果的影響最小，獲得較高過氧化值的最優(yōu)氧化反應條件為反應溫度10℃，反應時間5h，底物濃度225g/L，pH值9，空氣流速0.2m3/h，在此最佳條件下，最高過氧化值可達180mmol/kg脂肪。

[1]MOTTRAM DS.Flavour formation in meat and meat products:a review[J].Food Chem,1998,62(4):415-424.

[2]JAYASENA DD,AHND U,NAM KC,et al.Flavour chemistry of chicken meat:a review[J].Asian Austral J Anim Sci,2013,26(5):732-742.

[3]ZAMORA R,HIDALGOF J.The Maillard reaction and lipid oxidation[J].Lipid Technol,2011,23(3):59-62.

[4]李 耀.淺談雞肉風味物質的形成機理[J].食品工業(yè)科技，2011，32（3）：446-452.

[5]陳海燕，姜 梅.美拉德反應及其在咸味香精生產中的應用[J].中國調味品，2008（10）：38-41.

[6]肖朝耿，唐宏剛，陳黎宏.美拉德反應制備天然雞肉風味調料的研究[J].浙江農業(yè)學報，2012，24（3）：499-502.

[7]楊桂敏，謝建春，孫寶國.以酶催化氧化油脂的方法制備想味料的研究進展[J].食品科技，2006，31（10）：176-180.

[8]ELMORE JS,CAMPO MM,ENSER M,et al.Effect of lipid composition on meat-like model systems containing cysteine,ribose and polyunsaturated fatty acids[J].Agric Food Chem,2002,50(5):1126-1132.

[9]謝建春，孫寶國，劉晶鑫.氧化及未氧化脂肪對半胱氨酸-核糖體系熱反應肉香味形成的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（3）：1-5.

[10]GLIABERT MP,CARMONA FG.Chromatographic analysis of lipoxygenase products[J].Anal Chim Acta,2002,465(1-2):319-335.

[11]蔡 錕，方 云，夏詠梅.植物脂肪氧合酶的研究進展[J].現(xiàn)代化工，2003（增刊 2）：23-27.

[12]REDDANNA P,WHELAN J,MADDIPATI KR,et al.Purification of arachidonate 5-lipoxygenase from potato tubers[J].Method Enzymol,1990,187(29):268-277.

[13]蔡 琨.大豆脂肪氧合酶的提取及影響酶活因素的研究 [J].林產化學與工業(yè)，2004，24（2）：52-56.

[14]陳書婷，孔祥珍，華欲飛，等.大豆脂肪氧合酶的分離純化及其性質研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（5）：176-177.

[15]AL-OBAIDYH M,SIDDOIA M.Properties of faba bean lipoxygenase[J].J Food Sci,1981,46(2):622-625.

[16]鐘 秋，謝建春，孫寶國，等.“酶催化氧化雞脂-熱反應”制備雞肉香味[J].中國食品學報，2010，10（4）：124-129.