維藥新塔花中總黃酮純化工藝研究

李國柱，張宇陽，孟慶艷*

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

維藥新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.）為唇形科（Lamiaceae）新塔花屬（Ziziphora）植物，又名唇香草、小葉薄荷、山薄荷，在維吾爾語言中稱之為蘇則[1]。新塔花為多年生半灌木狀草本植物，喜生長于低山坡草地以及干旱坡地，我國僅在新疆有分布，在蒙古和哈薩克斯坦等地區也有所分布[2]。芳香新塔花作為傳統維吾爾藥材，在新疆民間被廣泛用于治療高血壓病、冠心病等心腦血管疾病[3-4]。全株地上部分均可入藥，其味辛性寒，芳香具有疏散風熱、清利頭目、寧心安神、利水清熱、壯骨強身、清胃消食之功能。主治感冒發熱、目赤腫痛、頭痛咽痛、心悸失眠等癥[5-6]。現代研究表明，芳香新塔花主要含揮發油、萜類、生物堿、黃酮類等化學成分。其中的黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性及營養保健作用[7-8]，研究芳香新塔花中總黃酮的純化工藝對提高芳香新塔花植物的生物利用率有實際意義。

目前，對于維藥芳香新塔花粗提物的研究，多在其提取方法上，而對于其最優純化工藝的研究卻不多。本實驗通過對芳香新塔花純化工藝的優化研究，得出新塔花純化工藝，為以后新塔花屬植物特色資源的利用提供參考。

馮云霞等[9-11]分別采用層析柱、樹脂吸附法對黃芩和芝麻葉中的黃酮類化合物進行了純化，但這些基本都未涉及樹脂的篩選和工藝條件的優化以及各因素對樹脂吸附解析的影響。大孔樹脂預處理采用王慧彥等[12]在B-8大孔樹脂對槐花總黃酮吸附性能研究中的方法。本實驗使用XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300、HPD-20樹脂吸附芳香新塔花提取液中的黃酮類物質，以樹脂對芳香新塔花總黃酮的吸附量和解吸率為指標，考察了不同吸附濃度、吸附速度、吸附時間和乙醇濃度的影響，為更好地分離純化新塔花總黃酮提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；大孔樹脂型號為型號為：XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300以及HPD-20：滄州恩寶化工有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產分析純試劑。

芳香新塔花藥材采自新疆昌吉州木壘縣龍王廟水庫，經鑒定為唇形科新塔花屬植物（Z.clinopodioidesLam.）的干燥地上部分。

1.2 儀器與設備

Cary-100型紫外-可見光分光光度計：美國瓦里安公司；VIC-412型電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；SB-2000恒溫水浴鍋、CA-1111冷卻水循環裝置：上海愛朗儀器廠；SK2200LH超聲儀：上海科導超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司。

1.3 RE-5220方法

以總黃酮的吸附率和解吸率為指標，用8種不同的大孔樹脂對芳香新塔花總黃酮進行靜態吸附與解吸。篩選出8種大孔樹脂中吸附量最大，解吸量最大的大孔樹脂。在此基礎上對總黃酮純化的上樣濃度，大孔樹脂梯度洗脫，徑高比，上樣液流速的影響進行研究。

1.3.1 樣品溶液的制備

總黃酮的提取：對200g芳香新塔花采用回流法，提取溫度為80℃、乙醇濃度為75%vol、提取時間為65min、提取次數為2次、料液比為1∶20進行總黃酮的提取，提取液濃縮至黏稠狀，烘干，備用。

標準曲線的繪制：采用AlCl3比色法[13-14]。精密稱取蘆丁標準品63.25mg于250mL容量瓶中，用70%vol乙醇定容至刻度，得到質量濃度為158μg/mL的標準品溶液。精密吸取對照品溶液0.00mL、1.50mL、3.00mL、4.50mL、6.00mL、7.50mL分別置于25mL容量瓶中，加入5%Na2NO20.75mL，搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.75mL，搖勻，放置6min，加入4%NaOH 10mL，加70%vol乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min，于波長510nm處測定其吸光度值，（標準曲線測定方法）以濃度（X，μg/mL）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.0158X-0.0125，相關系數r=0.9993（n=9），結果表明，蘆丁對照品溶液在0.53μg/mL～63.78μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

樣品溶液的配制：精密稱取0.94g芳香新塔花總黃酮，溶解于200mL水中，配制成溶液，備用。

1.3.2 大孔樹脂的預處理

用95%vol乙醇將樹脂浸泡24h，使其充分溶脹，95%vol乙醇濕法裝柱，然后用95%vol乙醇以0.33mL/min通過樹脂柱，流出液與少量蒸餾水（1∶5）混合后至無白色渾濁為止；再用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味；接著用5%HCl溶液以0.33mL/min通過樹脂柱，并浸泡4h，用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的pH值呈中性；最后用2%NaOH溶液以0.33mL/min通過樹脂柱，并浸泡4h，用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的pH值呈中性；浸泡于蒸餾水中，備用。

1.3.3 芳香新塔花中總黃酮對各種不同大孔樹脂的吸附與解吸實驗

靜態吸附實驗：稱取經過預處理的8種不同的大孔樹脂各2g，置于錐形瓶中，分別加入樣品溶液30mL于錐形瓶中。每隔20min搖晃1次，搖晃2h，然后靜置24h，按照“1.3.1”方法配制蘆丁對照液，測量每個溶液的吸光度值，用以下公式計算其吸附量、解吸量、吸附率及解吸率。

式中：C0為樣液中總黃酮初始質量濃度，mg/mL；C1為吸附后濾液中總黃酮質量濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；W為樹脂濕質量，g；C2為解吸液中總黃酮質量濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL。

靜態解吸實驗：將已經用總黃酮浸泡過的大孔樹脂過濾，過濾出來的大孔樹脂分別依次放入原來已經編號的錐形瓶中，各個錐形瓶中加入30mL、70%vol的溶液，浸泡，每隔20min搖動1次，連續2h，然后靜置24h。按照“1.3.1”方法配制蘆丁對照液。

1.3.4 進樣質量濃度對大孔樹脂影響因素的考察

稱取6份經過預處理的大孔樹脂各10g（干質量）濕法裝于各層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，量取6份質量濃度為9.20mg/mL的樣液各20mL，分別加入0mL、20mL、40mL、60mL、80mL、100mL蒸餾水稀釋，使樣品盡可能混合均勻充分溶解。上柱，控制流速為0.5mL/min，測定流出液總黃酮含量，計算吸附量及吸附率，選擇適宜的上樣濃度。

1.3.5 大孔樹脂的梯度洗脫

稱取10g經過預處理的HPD-600大孔樹脂濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中。量取濃度為4.70mg/mL的供樣液0.33mL/min上樣，控制流速為0.5mL/min，分別用蒸餾水、30%vol乙醇溶液、50%vol乙醇溶液、70%vol乙醇溶液、90%vol乙醇溶液梯度洗脫，每種溶液流速分別為0.33mL/min，分別收集各種洗脫液，按照“1.3.1”方法，測定每種溶液的吸光度值，計算每種溶液的解吸量和解吸率。

1.3.6 徑高比對大孔樹脂吸附總黃酮影響因素的考察

稱取4份處理好的HPD-600型大孔樹脂濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，使4個層析柱中徑高比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。分別在4個層析柱中加入樣品溶液125mL、100mL、75mL、50mL，控制流速為0.33mL/min，按照“1.3.1”方法配制蘆丁對照液，測定每種溶液的吸光度值，算出流出液的總黃酮含量，計算吸附率。

1.3.7 上樣液流速對大孔樹脂吸附總黃酮的影響因素的考察

用濕法裝柱（Φ1.5cm×40cm），將等量稱取的5份預處理好的大孔樹脂HPD-600按照徑高比為1∶10分別裝在5個層析柱中，精密量取5份蘆丁對照液100mL，分別控制上樣液體流速為0.17mL/min、0.33mL/min、0.5mL/min、0.67mL/min、0.83mL/min，按照總黃酮標準曲線的測定方法配制溶液，測定吸光度值，計算每種溶液的吸附量。

1.3.8 大孔樹脂動態吸附泄露曲線考察

將預處理好的HPD-600型號的大孔樹脂用濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，加入蘆丁對照液，上樣液流速控制在0.5mL/min，徑高比為1∶10，每0.17mL/min收集一次。共收集18份。測定每份洗脫液總黃酮含量。

1.3.9 樹脂的強化再生方法

樹脂使用一定的周期后，吸附能力會有所下降，尤其當被污染已經很嚴重的時候，吸附能力降低較大的時候需要強化再生。其方法是，在容器中加入高于樹脂層10cm的2%～3%的鹽酸溶液浸泡2h～4h，然后用鹽酸溶液0.5mL/min過柱子，并用蒸餾水洗至中性；繼續用5%的氫氧化鈉溶液浸泡至2h～4h，并同時用同濃度的氫氧化鈉溶液0.5mL/min過柱子，最后再用蒸餾水清洗至中性，再用乙醇0.33mL/min～0.5mL/min過柱子，然后用蒸餾水洗去乙醇，用蒸餾水浸泡備用[15]。也可以加入部分新樹脂補充再生損耗或者新舊樹脂套用。

2 結果與分析

2.1 對大孔樹脂靜態吸附與解吸測定結果

圖1 各型大孔樹脂對芳香新塔花總黃酮的吸附量與解吸量Fig.1 Adsorption and desorption capacity of different types of macroporous resins for total flavonoids from Ziziphora clinopodioidesLam

由圖1可知，D-101型和DM-130雖然解吸率比較大，但是其吸附率不高。XAD-7HP、HPD-20、AB-8、HPD-300、X-5的吸附率和解吸率均不好。因此HPD-600型號的大孔樹脂為這8種中的最佳選擇。

2.2 進樣質量濃度對HPD-600型大孔樹脂吸附總黃酮的影響的結果

圖2 進樣質量濃度對HPD-600型大孔樹脂吸附總黃酮的影響Fig.2 Effect of sample loading concentration on adsorption rates of HPD-600 macroporous resin for total flavonoids

由圖2可知，進樣質量濃度不能過大也不能過小，質量濃度過大或過小都不利于大孔樹脂對芳香新塔花總黃酮的吸附，濃度過大，會造成總黃酮的浪費，使其吸收不完全；質量濃度過小，大孔樹脂不能充分利用。因此，質量濃度為4.70mg/mL的進樣液比較適宜。

2.3 洗脫液濃度考察結果

表1 洗脫液濃度考察Table 1 Determination of eluent concentration

由表1可知，總黃酮主要集中在30%vol、50%vol和70%vol的乙醇溶液中，因此，可以把30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脫液合并利用。總黃酮分布于不同濃度的乙醇溶液中，原因是黃酮中帶有不同的基團，因而極性不同，不同極性的黃酮由不同濃度的乙醇溶液洗脫而出，因而總黃酮分布于不同濃度的溶液中。

2.4 徑高比對吸附量的影響結果

由圖3可知，隨著徑高比的增加，大孔樹脂吸附總黃酮能力也在增加。徑高比為1∶10的時候，大孔樹脂對總黃酮的吸附較好。因此，徑高比確定為1∶10。

2.5 進樣流率對HPD-600型大孔樹脂吸附的影響結果

由圖4可知，HPD-600型大孔樹脂對總黃酮的吸附量隨進樣流速的增加也逐漸增加，當進樣流速增加到一定程度時，吸附量反而會下降。因為當流速過大的時候，進樣液和大孔樹脂接觸時間減少，吸附不夠充分，吸附量也會隨著進樣流速的增加而降低，所以上樣液的流速不能過大，也不能過小，因此，上樣液流蘇控制在0.5mL/min。

圖3 徑高比對吸附率的影響Fig.3 Effect of diameter height ratio on the adsorption rate

圖4 進樣流速對HPD-600型大孔樹脂吸附的影響Fig.4 Effect of sample loading flow rate on adsorption of HPD-600 macroporous resin

2.6 HPD-600型大孔樹脂動態吸附泄露曲線

圖5 HPD-600型大孔樹脂動態吸附泄露曲線Fig.5 Leakage curve for the dynamic adsorption of HPD-600 macroporous resin

由圖5可知，開始洗脫時，洗脫液中的總黃酮含量是隨著洗脫體積的增加而提高，當洗脫到第16份總黃酮流出液后，流出液的總黃酮含量增加趨于平穩，達到上樣液的濃度，結果表明大孔樹脂的吸附已經達到飽和。因此，最大的上樣量為2.67mL/min。

3 結論

實驗通過對8種不同型號的大孔樹脂的吸附與解吸性能進行比較，結果表明，HPD-600型號的大孔樹脂是最適用于純化芳香新塔花總黃酮成分的樹脂。同時采用HPD-600型號大孔樹脂柱層析純化芳香新塔花總黃酮最佳條件為上樣液濃度為4.70mg/mL，徑高比為1∶10，上樣液流速為0.5mL/min，洗脫時合并30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脫液。

研究可以發現，上樣液體的濃度不宜過大，但是也不能過小。過大造成總黃酮溶解不充分，造成有效成分浪費，而且總黃酮會沉淀在大孔樹脂上，降低樹脂的使用壽命，流速也會越來越慢，得不到控制，對實驗結果會有很大的影響。濃度過小，大孔樹脂不能充分利用。在選用洗脫液濃度（乙醇濃度）的時候，乙醇濃度也不能過大，過大不能對吸附在大孔樹脂上所吸附的總黃酮進行洗脫，并且對乙醇也會造成浪費。在上樣流速的測定時，上樣流速不能太快，流速太快，上樣液和大孔樹脂接觸時間不夠，大孔樹脂對溶液中的芳香新塔花總黃酮吸附不夠充分，吸附量也會隨著流速的增加而降低。因此，也要控制好上樣液的流速。

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