大鼠疼痛模型研究進展＊

沈立姿，房立叢，于津鵬，朱曉鵬，胡遠艷，長孫東亭 綜述，羅素蘭審校

（海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室／海南大學海口市海洋藥物重點實驗室，海口570228）

疼痛是實際的或潛在的組織損傷所引起的一種不愉快的感覺也是一種預警機制，防止機體遭受壓迫或進一步損傷。疼痛包括機體受到傷害性刺激后的痛感覺和所做出的痛反應。按疼痛的發病機制，可分為生理性疼痛和病理性疼痛兩種，而后者又可分為炎性疼痛和神經病理性疼痛。1994年，國際疼痛研究協會［1］（IASP）將之定義為“一種與組織損傷或潛在的與損傷相關的不愉快的主觀感覺和情感體驗”。

疼痛并不是單一的感覺，它有復雜的發病機制［2－3］。雖然止痛藥可以緩解不同類型的疼痛，但它的作用機制是千差萬別的。因此，用單一的動物模型評價某種鎮痛藥藥效是不完善的。炎癥性痛是由于局部炎癥病灶內鉀離子、氫離子的積聚和炎癥介質的刺激引起的。神經源性疼痛是由于疾病或外周、中樞神經損傷引起的疼痛綜合征，是外周和中樞敏感化的結果。并且是臨床上常見的疼痛，其發病機制比較復雜，治療效果不盡理想。有報道統計美國約有1%的人患神經性疼痛，在當今世界這是一個相當可觀的數字，已引起科學家的注意。動物模型被廣泛地用于模仿各種疾病，并且用于研究各種臨床疾病的發病機制。盡管不同的動物模型都有其局限性，但如同臨床上疼痛的癥狀不完全相同，動物模型亦各有其特點，發生機制也不完全相同。本文將從物理刺激，化學刺激，神經疼痛3個方面為大家介紹幾種大鼠疼痛模型及其研究進展。

1 物理刺激法

物理刺激主要是指機械、熱、電等外界刺激引起機體產生一系列的反應。痛覺過敏是指皮膚對機械刺激產生過度敏感的現象，也是神經損傷后的一個特征重復性的傷害刺激可以導致持續性的疼痛，因此在實驗過程中可以通過測量疼痛的閾值來間接量化疼痛的程度，使疼痛程度變成一個直觀的數值。

1.1 大鼠機械痛覺測試 將實驗大鼠放置在有機玻璃觀察格中，觀察格則放在頂部有網眼的金屬架上，以方便von Frey測試。從而測定大鼠機械性縮足反射閾值（MWT）［4］。大鼠適應環境半小時，待大鼠不再四處張望、探究，較安靜后，實驗者用von Frey測試探針緩慢地輕柔地刺激大鼠待測后肢足底中部，使探針彎曲，持續幾秒鐘觀察大鼠的縮足反應，大鼠若由于刺激而出現快速的縮足反應，則標記為陽性反應，若由于身體活動引起大鼠的縮足反應則不算在內。反復測量找到出現50%陽性反應時的壓力值，這個值就是該只大鼠的MWT。Harry等［5］利用此方法確定了α－芋螺毒素可以明顯增高神經結扎模型大鼠的機械痛閾值。α－芋螺毒素能選擇性抑制N型Ga2＋通道從而減輕特異性疼痛有望被開發成治療慢性疼痛的藥物。

1.2 大鼠熱痛覺測試 大鼠適應性喂養，室內環境保持在25℃左右，將熱板儀的溫度設置在保持54℃左右。大鼠被放置在有密閉可拆卸的透明有機玻璃缸內的熱板儀上記錄其出現舔后足或跳躍反應的時間。Casarrubea等［6］確定此模型可用于鎮痛藥物的篩選也可用于增強學習能力，記憶能力等藥物的研究。筆者實驗室曾應用此模型篩選出一些有鎮痛活性的芋螺毒素。

1.3 大鼠切口疼痛模型的建立 取清潔級SD大鼠麻醉，碘伏消毒大鼠一側后足，用手術刀在大鼠足底做一長約5mm的縱向切口，用鑷子夾起足底肌肉，并在切口左右縱向切割，動作輕柔保證其起止附著點的完整，用絲線縫合皮膚，并給予青霉素粉針，造模成功［7］。本模型制作簡單，傷害直觀，為術后鎮痛藥物的研究和開發提供了條件。Grzegorz等［8］通過實驗確定μO－芋螺毒素可以提高切口疼痛模型大鼠的機械痛閾值，并且不會阻礙傷口的愈合。Sylvia等［9］確定脊髓部位的γ氨基丁酸（GABA）可以調節本模型大鼠痛覺過敏。筆者對上述3種物理刺激模型簡單的進行了比較，見表1。

2 化學刺激法

許多刺激性化學物質接觸皮膚黏膜或注入體內，均能引起炎性疼痛反應，可用作疼痛模型的制作，可用以研究疼痛生理及篩選鎮痛藥物。

2.1 大鼠足底炎性疼痛模型的建立 實驗環境25℃，將大鼠放置在特制鼠籠里，大鼠右后足可伸出鼠籠，實驗者左手固定大鼠右后足。用1mL注射器抽取100μL的5%甲醛溶液注射到大鼠有后足足底皮下，制作甲醛疼痛模型。王靜捷等［10］酵母聚糖制作本模型，發現Zymosan表現出比Formalin更穩定的，可靠地熱痛覺過敏和機械痛覺過敏，并有明顯的水腫。Seungkyu等［11］通過實驗確定ω－芋螺毒素FVIA作用于N型Ca2＋通道，可以減少甲醛誘發的傷害性行為的累計時間，并且對與炎性疼痛和中樞致敏密切相關的第二時相更為有效。Yan等［12］也是利用本模型通過鞘內給藥的方法確定ω－芋螺毒素SO－3也具有鎮痛作用，并且有劑量效應。

甲醛誘導的炎性痛可表現為兩個時相，第一時相為皮下注射甲醛后立即表現出的疼痛行為，是由甲醛直接刺激神經末梢所引起；第二時相為皮下注射甲醛約20min后發生的疼痛行為，是由于局部慢性炎癥導致的傷害性信息持續傳入引起的。大鼠在兩個時相所表現出的痛反應是頻繁的舔注射足。兩個時相之間有一個10～15min的相對穩定期，這一時間內實驗大鼠很少表現傷害性反應行為，較為安靜。

表1 物理刺激模型特點簡明比較

表2 化學刺激模型特點簡明比較

2.2 大鼠關節炎模型的建立 大鼠以40mg／kg水合氯醛麻醉，將0.1mL的完全弗氏佐劑（CFA）注射到大鼠后足跖皮下，約4h后可出現原發性病變，注射點附近出現紅腫。此現象可持續5d而7d后大鼠四肢的關節和腳掌部位會出現腫脹等繼發性病變。陸繼娣等通過實驗確定中藥熏蒸可以降低本模型大鼠血液和關節中的致炎因子白細胞介素的含量，并且存在劑量效應。Ekberg等［13］確定出μΟ－型芋螺毒素 MrVIB選擇性阻斷感覺神經元的Nav 1.8通道，對不引起運動障礙的慢性疼痛有效，同時也可以提高本模型大鼠的痛閾值。Toru等［14］利用Zymosan成功制作了大鼠關節炎疼痛模型，并確定在關節腔內注射骨形成蛋白7（BMP－7），通過提高BMP－7的水平和減少白細胞介素1β（IL－1β）的水平，從而對炎癥性關節炎模型的軟骨退變起到保護作用。

2.3 偏頭痛大鼠模型的建立 取SD大鼠硝酸甘油注射劑，注射劑量按照15mg／kg進行皮下注射，實驗大鼠2只耳朵紅腫，且不停的左右甩頭，用前肢抓撓頭部毛發，煩躁，來回走動，用頭部輕頂鼠籠，此現象持續2～3h后，大鼠安靜的趴窩在鼠籠中，活動明顯減少，模型制作成功。趙永烈等［15］通過本模型從組織學上確定芎芷地龍湯可以減少由硝酸甘油誘導的c－fos的表達，增加五羥色胺的表達，減少三叉神經脊束核神經細胞的興奮性，激活五羥色胺下行鎮痛系統，并且可持續較長時間，增高痛閾，阻止痛覺信息的傳遞，從而起到鎮痛作用。彭成等人檢測出在本模型大鼠的腦組織c－fos和c－jun基因表達異常。筆者對上述3種化學刺激模型簡單的進行了比較，見表2。

3 神經病理性痛模型

神經源性疼痛是由于疾病或外周、中樞神經損傷引起的疼痛綜合征，是外周和中樞敏感化的結果，其中脊髓敏感化起著十分重要的作用。機體的中樞或外周神經組織損傷后神經系統的結構和功能發生病理性改變，從而引起痛覺異常和痛覺過敏。

3.1 大鼠坐骨神經分支選擇性損傷型神經病理痛模型（SNI）的建立 實驗室溫度保持在25℃，實驗大鼠采用腹腔給藥的方式進行麻醉，大鼠俯臥置于手術臺上，右后腿剪毛，消毒，用手術剪剪開腿部皮膚［16］，逐層分離皮下脂肪、淺筋膜，雙手執眼科鑷鈍性分離股二頭肌，使坐骨神經主干暴露在視野內，結扎并剪斷其分支脛神經、腓總神經，保留并避免損傷腓腸神經，逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術后的感染。姜艷華等［17］利用本模型確定米諾環素可通過減少標記小膠質細胞（OX－42）的表達進一步抑制脊髓小膠質細胞的激活，最終達到減輕痛覺超敏和痛覺過敏的現象，并確定米諾環素具有劑量效應。Metz等［18］研究發現SNI模型大鼠的神經元樹突比假手術大鼠的樹突更長，分支也更多。

3.2 大鼠坐骨神經慢性擠壓傷病理性痛模型（CCI）的建立實驗室溫度保持在25℃，實驗大鼠采用腹腔給藥的方式進行麻醉，大鼠俯臥置于手術臺上，右后腿剪毛，消毒，用手術剪剪開腿部皮膚，逐層分離皮下脂肪、淺筋膜，雙手執眼科鑷鈍性分離股二頭肌，使坐骨神經主干暴露在視野內，用鑷子將坐骨神經主干輕輕剝離，在坐骨神經干上每間隔約1mm用3－0鉻制羊腸線做4個結扎，在結扎時保持力度一致，結扎強度以不完全阻斷血管為宜，結扎時可見肢體輕微抽動。逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術后的感染。在本模型的發展過程中，也有人用不同材料如羊腸線、絲線、PE套管等對大鼠坐骨神經進行擠壓，最終確定羊腸線和絲線經生理鹽水浸泡后使用效果穩定，并且羊腸線更適用于此模型的制備［19］。Narmatha等［20］通過不同的給藥部位確定α－芋螺毒素Vc 1.1可以提高大鼠的痛閾值。并且通過不同的給藥部位（手術側后肢，對側后肢）確定其對大鼠的受損神經有修復作用。Richard等［21］認為用未成年大鼠制作CCI模型機械痛更易誘發炎性痛，并與人類新生兒神經損傷后的臨床表現一致，保障研究人員進一步探索神經痛的發病機制和治療方法。Joseph等［22］研究表明，ZZ－204G是一種作用于a9a10受體的小分子拮抗劑，是一種新型結構的鎮痛劑。在治療慢性炎癥和神經性疼痛方面有潛在的應用前景。筆者實驗室就采用此模型對芋螺毒素的鎮痛活性進行篩選，先建立大鼠的CCI模型，喂養1周后對合格大鼠做鞘內置管作為中樞給藥的給藥途徑。

表3 神經病理性疼痛模型特點比較

3.3 大鼠脊神經結扎模型的（SNL）建立 實驗人員將大鼠麻醉，讓其俯臥在手術臺上，大鼠背部褪毛消毒，將腰部位置墊高，左手用鑷子拉起大鼠L5－L6脊椎間的皮膚，右手用手術剪將其剪開，作一皮膚縱切口，鈍性分離皮下的肌肉，使L5－L6關節突暴露在手術視野內，無菌條件下切除關節突，輕輕地分離L5－L6脊神經，用絲線結扎L6的背根神經節，逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術后的感染。Aldric等［23］通過實驗確定芋螺毒素MVⅡA和con－G可以明顯提高脊神經結扎模型大鼠的痛閾值，con－G降低周圍神經痛的效果要強于甲醛模型的疼痛。

3.4 大鼠骨癌疼痛模型的建立 Medhurst等［24］將乳腺腫瘤細胞在培養基上擴大培養，用胰蛋白酶溶液降解，離心，用平衡鹽溶液洗滌沉淀，在離心洗滌2次，最后腫瘤細胞會懸浮于鹽溶液中，備用。大鼠麻醉后，在脛骨上段開一小口，先在脛骨干骺端穿刺打孔，再注入腫瘤細胞混懸液，用醫用骨蠟封堵針孔，建立大鼠脛骨骨癌模型。有些研究者曾用前列腺腫瘤細胞成功制作大鼠骨癌疼痛模型，并確定腫瘤可以激活脊髓神經膠質細胞釋放IL－1β和其他物質使痛覺過敏［25］。Anton等［26］確定作用于N－型電壓敏感性鈣離子通道的ω－芋螺毒素來考諾太與嗎啡合用對骨癌疼痛模型大鼠有協同鎮痛作用。Wala等［27］的研究表明，ZZ1－61c是作用于a9a10膽堿受體，有獨特拮抗作用的新型化合物，對預防和減弱化療導致的神經性疼痛有潛在的研究價值，因此它為避免膽堿受體激動劑的毒性提供了有效的治療方法。筆者對上述4種神經病理性痛模型簡單的進行了比較，見表3。

4 討 論

疼痛是機體受到損害后一種保護性反應，也是某些疾病的一種癥狀，可使人感到痛苦。某些長期劇烈的疼痛對機體已成為一種難以忍受的折磨，使人們生活質量下降，對工作生活不利，這引起了科研人員的廣泛關注。鎮痛藥物的研究是目前醫學中最活躍的領域之一，由于疼痛的發病機制不同，因此各種疼痛模型的制備顯得尤為重要。目前，筆者實驗室正在選用上述模型，對被譽為“海洋藥物寶庫”的海南產芋螺毒素進行鎮痛活性篩選，和藥效評價，已篩選到鎮痛作用強大、作用靶點清楚、無成癮性的新型芋螺毒素先導藥物，為下一步原創新型鎮痛藥物的研發奠定了堅實的基礎。

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