Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路在2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血早期作用的研究＊

王文娟，武曉寧，賈玉潔，谷 成，閔連秋△

（1.遼寧醫學院研究生學院，遼寧錦州 121000；2.遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧錦州 121001）

近些年來，糖尿病合并腦梗死的發病率逐年升高，給人們的健康帶來了嚴重的威脅。糖尿病已經被認為是腦梗死的獨立危險因素，能加重神經細胞的凋亡，增加了腦梗死的致殘率和病死率，嚴重地影響了患者預后的生活質量。有關糖尿病加重腦梗死的機制近年來研究較多，但具體機制至今尚未明確［1］。本實驗旨在探討大鼠局灶性腦缺血早期Ras／Raf／絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivatedp rotein kinase kinase，MEK）／細胞外信號調節激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）信號傳導通路的作用，以及糖尿病加重腦梗死與Ras／Raf／MEK／ERK傳導通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康的雄性SD大鼠，體質量280～330g，由遼寧醫學院動物實驗中心提供，合格證號［SCXK（遼）2003－0007］。PD98059 由 德 國 默 克 公 司 提 供 （批 號 51300I）；p－ERK1／2一抗、二抗均由北京博奧森生物有限公司提供，末端脫氧核苷酸轉移酶接到的dUTP原位切口末端標記（TUNEL）試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病（T2DM）大鼠腦缺血模型的建立 取SD大鼠常規飼料適應性飼養1周，然后喂飼高脂高糖飼料（10%豬油，2.5%膽固醇，1.0%豬膽酸鹽，20.0%糖，66.5%常規飼料［2］）。4周后，按25.0mg／kg［3］體質量的劑量一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液。72h后取尾血測血糖，血糖超過16.7mg／kg為T2DM大鼠［4］。選取T2DM造模成功的SD大鼠，按照文獻［5］制作大鼠大腦中動脈缺血模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。麻醉后的SD大鼠頸部正中切口，暴露并鈍性游離左側頸總動脈（common carotid artery，CCA），結扎同側CCA近心端和頸外動脈（external carotid artery，ECA）分叉部，距CCA末端約5mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產尼龍線（直徑0.235mm，長6 cm）插入，以頸總動脈分叉處計算進線深度為（18.0±0.5）mm，至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供。假手術組手術步驟同上，但不插入線栓。

1.2.2 分組與給藥 將大鼠分為假手術組、健康大鼠腦缺血組、T2DM大鼠腦缺血組、PD98059組，每組12只。假手術組是選取健康大鼠只游離出動脈不進行栓塞；健康大鼠腦缺血組是選取血糖正常，進行MCAO造模成功的大鼠；T2DM腦缺血組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠；PD98059組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠，此組大鼠于 MCAO術前30min尾靜脈注射 PD98059（3mL／kg）。MCAO術2h后各組取6只大鼠麻醉、處死、灌流、石蠟包埋固定制成病理切片；每組剩余的6只大鼠迅速取缺血側大腦海馬，保存于－80℃冰箱。

1.2.3 評價標準 參照Bederson 6級5分評分標準，對大鼠MCAO術后2h進行3次神經功能評分，平均值大于或等于2分提示造模成功，評分標準見表1。

表1 Bederson評分標準

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 TUNEL法檢測大鼠腦組織神經細胞凋亡 切片常規脫蠟水化，3%H2O2室溫處理后蛋白酶K于37℃消化10 min，標記液32℃標記2h，后封閉30min，生物素化地高辛抗體37℃反應37min。加SABC、DAB顯色，常規封片。在海馬CA3區不重復隨機選取5個高倍視野，在400倍光鏡下計算陽性細胞（陽性細胞數／計數細胞總數）100% 。

1.2.4.2 免疫組化法檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達 采用SABC法按照免疫組化試劑盒說明進行。顯微鏡下觀察缺血側大腦海馬CA3區p－ERK1／2表達情況，每張免疫組化切片中采集5個具有代表性的高倍視野，在400倍光鏡下計數海馬CA3區p－ERK1／2的陽性細胞數。

1.2.4.3 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達 將凍存的腦組織剪碎置于裂解液中機械勻漿，4℃17 000r／min離心1h，取出上清液。用考馬斯亮藍G250結合法，根據已知牛血清清蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，置于沸水浴中5min使蛋白變性。制備7.5%分離膠和4%濃縮膠，將樣品加在凝膠表面的樣品槽中，電泳后轉移至硝酸纖維素膜上。5%奶粉TTBS緩沖液振蕩封閉3h后洗膜，分別加入一抗、β－actin，4℃冰箱孵育1夜。洗膜，辣根酶標記，室溫孵育1h，洗膜后進行增強化學發光（enhanced chemilum inescence，ECL）反應1～3min，暗室曝光，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統攝像分析測定目標帶的光密度（integrated density value，DV），計算出各指標各組目標帶與β－actin DV比值。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示。組間顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠神經行為學評分 T2DM大鼠腦缺血組較健康大鼠腦缺血組神經行為學評分明顯增高，而PD98059組神經行為學評分明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 大鼠神經行為學評分

2.2 免疫組織化學測定大鼠缺血側大腦海馬CA3區p－ERK1／2蛋白的表達 p－ERK1／2陽性染色呈深棕色，常存在于神經元胞漿中，磷酸化后轉移至細胞核。陽性染色的神經細胞核呈深棕色，多數發生形態學改變，胞核皺縮，核仁偏位或者缺失。假手術組偶見p－ERK1／2陽性蛋白表達。健康大鼠腦缺血組可見p－ERK1／2陽性神經細胞核，T2DM大鼠腦缺血組陽性胞核增多，PD98059組陽性胞核明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3、圖1。

2.3 Western blotting測定大鼠缺血側海馬p－ERK1／2蛋白

p－ERK1／2蛋白在假手術組表達較少，在健康大鼠腦缺血組和T2DM大鼠腦缺血組表達較多，且T2DM大鼠腦缺血組增高明顯P＜0.01，而p－ERK1／2蛋白在PD98059組表達明顯減少，見表4、圖2。

2.4 TUNEL法檢測大鼠缺血側大腦海馬CA3區神經細胞凋亡情況 凋亡的神經細胞核為棕黃色顆粒。假手術組海馬CA3區偶見神經細胞凋亡，健康大鼠腦缺血組缺血側海馬CA3區見較多神經細胞凋亡，T2DM大鼠腦缺血組凋亡率較健康大鼠腦缺血組明顯升高（P＜0.01），而PD98059組凋亡率明顯下降，見表5。

表3 免疫組織化學測定大鼠缺血側大腦海馬CA3區p－ERK1／2陽性細胞數

圖1 免疫組織化學測定大鼠缺血側大腦海馬CA3區p－ERK1／2陽性表達（×400）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

＊：P＜0.01，與假手術組比較；＃：P＜0.01，與健康大鼠腦缺血比較。

組別 n 6 0.003 2±0.000 1健康大鼠腦缺血組 6 0.012 4±0.000 2＊T2DM大鼠腦缺血組 6 0.038 4±0.001 7＊＃PD98059組 6 0.007 4±0.000 1＊＃灰度比值假手術組

圖2 Western blotting法檢測大鼠缺血側海馬p－ERK1／2蛋白的表達

表5 大鼠缺血側大腦海馬CA3區神經細胞凋亡率

3 討 論

腦缺血后神經細胞的凋亡是一個動態進行的過程，在早期（30min時）缺血區會出現明顯的水腫，水腫區的周圍出現少量的凋亡細胞，隨著缺血時間的延長神經細胞的凋亡數目增加，凋亡的神經細胞主要位于缺血半暗帶區，而缺血中心區細胞的死亡以壞死為主［6］，因此選取大鼠海馬CA3區作為觀察區域。本實驗主要研究大鼠腦缺血早期神經細胞的凋亡情況及與Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路的關系，所以選取MCAO術后2h作為觀察的時間點。

Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路是一條可以被多種因素廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶：（1）MAPKKK，是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Raf為其中重要的一員；（2）MAPKK，具有磷酸化蘇／酪氨酸殘基的雙特異功能，Mek為其中重要的一員；（3）MAPK是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Erk即為其中重要的一員［7］。是當Ras受到細胞外信號刺激時，即轉化為激活型Ras，激活型Ras繼而激活Raf－1；而Raf－1可將 MEK磷酸化激活，p－MEK進一步磷酸化ERK1／2，然后p－ERK1／2再將細胞核內的 ElK－1L磷酸化，此瀑布式的激活過程將神經細胞外的信號通過細胞膜、細胞質傳遞到細胞核，來調節細胞周期調控細胞的增殖、分化和凋亡等生理病理過程［8］。PD98059是ERK的上游激酶 MEK－1特異性阻斷劑，能夠阻斷Ras／Raf／MEK／ERK信號通路的傳導，從而影響了細胞的命運。本實驗采用TUNEL染色法，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠MCAO術后2h海馬CA3區神經細胞凋亡變化，并通過免疫組織化學、Western blotting，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠p－ERK1／2蛋白表達變化，以明確Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路是否參與了T2DM加重腦缺血損傷時的神經細胞凋亡，從而進一步明確高血糖、高血脂加重腦缺血損傷的機制。從實驗結果看，與健康大鼠腦缺血組相比，T2DM大鼠腦缺血組的p－ERK1／2蛋白表達明顯增加（P＜0.01），免疫組織化學與 Western blotting結果一致。TUNEL結果顯示，健康大鼠腦缺血組有部分神經細胞凋亡，而T2DM大鼠腦缺血組凋亡率明顯升高（P＜0.01），可見高血糖、高血脂能引起P－ERK1／2蛋白上調從而加重了神經細胞的凋亡。

可以推論 Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路可能是T2DM加重缺血性腦損傷機制中的一條重要的信號傳導通路。但從實驗結果看，阻斷了Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路僅能部分抑制神經細胞的凋亡，經PD98059干預的缺血組其神經細胞的凋亡率仍明顯高于假手術組（P＜0.01），這與付度關［9］得出的結論一致，這又進一步說明了神經細胞凋亡機制的復雜性，需要更進一步的研究。

［1］ Li PA，He QP，Ouyang YB，et al.Phosphorylation of extracellular signal－regulated kinase after transient cerebral ischemia in hyperglycemic rats［J］.Neurobiol Dis，2001，8（1）：127－135.

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［3］ 陳秋，夏永朋，邱宗蔭，等.2型糖尿病大鼠模型的建立與評價［J］.天津醫藥，2006，34（1）：33－35.

［4］ 司曉晨，尚文斌，卞慧敏，等.鏈脲佐菌素加高脂膳食誘導2型糖尿病大鼠模型［J］.安徽：中醫臨床雜志，2003，15（5）：383－385.

［5］ 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（PMCAO）的實驗研究［J］.吉林醫學，2004，25（10）：16－17.

［6］ 儲照虎，吳家幕，劉富東，等.大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡及其調控基因的表達［J］.臨床神經病學，2000，13（3）：134.

［7］ 李英，段惠軍.Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導通路在糖尿病腎病發生發展中的作用［J］.國際內分泌代謝雜志，2007，27（4）：269.

［8］ Hu BR，Liu CL，Park DJ.Alteration of MAP kinase pathways after transient forebrain ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20（7）：1089－1095.

［9］ 付度關.ERK對缺血缺氧性腦損傷后神經細胞凋亡的影響［J］.卒中與神經疾病，2007，14（6）：346－349.